(武漢科技大學附屬漢陽醫(yī)院口腔科，湖北 武漢 430050)

隨著我國社會經(jīng)濟快速發(fā)展，居民生活水平和醫(yī)療水平的不斷提升，平均壽命明顯增加；統(tǒng)計學顯示，在2000年我國已進入老齡化社會，2010年我國60歲及以上的老年人口數(shù)已超過1.8億，占總?cè)丝跀?shù)的10.6%，位居世界首位。傳統(tǒng)觀點中口腔正畸治療多適用于12～18歲青少年，在中老年人群中開展較少。但有學者研究認為，年齡不是決定能否進行口腔正畸的主要因素，人牙周膜細胞成骨化活性起決定性作用。口腔正畸治療中在機械力刺激下能夠引發(fā)牙周組織改建，最終牙齒移位達到矯治目的。人牙周膜細胞在正畸牙移動過程中發(fā)揮重要的生理介質(zhì)活性，能夠通過細胞增殖和分化反應機械力刺激，表達成骨相關因子。

牙周膜是連接牙齒與牙槽骨的結(jié)締組織，能夠?qū)⒀例X受力傳至牙槽骨，在牙周組織改建中發(fā)揮重要作用[1]。人牙周膜細胞是牙周膜的主要成分，可將機械力信號轉(zhuǎn)化為生物信號[2]。研究者發(fā)現(xiàn)，在牽張應力、擠壓應力等刺激能夠上調(diào)牙周膜細胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、OCN等成骨相關基因的表達[3]。Runt相關基因2是成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，介導骨形成與骨重建，可通過特有的結(jié)構域與下游靶基因結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄，上調(diào)成骨細胞表型分化和干細胞向成骨細胞特異性分化[4]。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)1/2屬于MAPKs超家族，在細胞增殖、凋亡等多種生物學行為中發(fā)揮調(diào)控作用[5]。相關研究顯示，Erk1/2、Runt相關基因2為力學信號的靶點[6]，但關于其在人牙周膜細胞成骨化中的作用仍鮮有研究報道。本研究在體外使用周期性牽張應力刺激牙周膜細胞來模擬口腔中牙周膜所受的咬合力，檢測牙周膜細胞中Erk1/2及成骨相關基因表達情況，探討牽張應力刺激下Erk1/2在人牙周膜細胞成骨化中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集2018年1月至12月間在本院行口腔正畸治療拔除的健康前磨牙，用于原代培養(yǎng)人牙周膜細胞，患者年齡10～16歲，均簽署知情同意書。主要試劑：胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于北京裕恒豐科技有限公司；ERK1/2通路抑制劑PD98059購于上海翊圣生物科技有限公司；ERK1/2顯性負性突變體構建與鑒定由上海捷瑞生物工程有限公司完成；鼠抗人ERK1/2、p-ERK1/2單克隆抗體，鼠抗人Runt相關基因2單克隆抗體購于上海百力格生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人牙周膜細胞培養(yǎng)與模型構建 采用組織塊法和消化法原代培養(yǎng)人牙周膜細胞，培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，收集第5代細胞，免疫組化法檢測Vimentin、角蛋白表達，鑒定細胞來源。胰蛋白酶消化第5代細胞，細胞計數(shù)后按1×106/mL接種于FlexcellBioFlex細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24～48 h，光學顯微鏡下觀察細胞融合度超過80%時，將培養(yǎng)基中胎牛血清濃度更換為3%，繼續(xù)培養(yǎng)24天。將細胞分為牽張應力組、對照組，牽張應力組使用FX-5000 T應力加載系統(tǒng)分別刺激細胞1、3、6、12、24 h，振幅10%、頻率0.5 Hz，每個循環(huán)中松弛和拉伸時間各1 s；對照組在相同系統(tǒng)中培養(yǎng)，但不給予牽張應力刺激。

1.2.2 ERK1/2通路抑制劑PD98059處理 取第5代人牙周膜細胞按1×106/mL接種于6孔板中，分為3組：對照組僅使用含二甲基亞砜的α-MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，不加牽張應力；牽張應力組使用含二甲基亞砜的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，通過應力加載系統(tǒng)刺激細胞3 h；ERK1/2通路抑制劑組先將PD98059溶于二甲基亞砜，配置100 mmol/L的PD98059儲備液，加入α-MEM培養(yǎng)基中使其終濃度為20 μmol/L，培養(yǎng)1 h后，通過應力加載系統(tǒng)刺激細胞3 h。

1.2.3 ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染 取第5代人牙周膜細胞按1×106/mL接種于6孔板中，分為3組：對照組使用α-MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；空載體轉(zhuǎn)染組、ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染組分別取空載體、ERK1/2顯性負性突變體慢病毒原液1 mL，按MOI值比例100加入細胞培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，之后每48 h更換1次培養(yǎng)基，7天后共聚焦顯微鏡下觀察人牙周膜細胞轉(zhuǎn)染情況。將轉(zhuǎn)染成功后的空載體轉(zhuǎn)染組、ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染組再各分2個亞組：牽張應力組(應力加載系統(tǒng)刺激細胞3 h)、靜止組(不加牽張應力)。

1.2.4 RT-PCR檢測 Trizol法提取人牙周膜細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Runt相關基因2、ALP、OCN、β-actin引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。Runt相關基因2上游5′-AATTATCGCACGACGGTAAGC-3′，下游5′-ACCTACTTAGAC AAACCGCTG-3′；ALP上游5′-TCGCGGACCCAGA GAAGTGAT-3′，下游5′-AGC CGAAAGTCCTCCGGATA-3′；OCN上游5′-AAGACGTAACCGAGGTCACT G-3′，下游5′-TGTTGGAGAGGTTTA CCACCC-3′；內(nèi)參β-actin上游5′-TGAGGCTGGA AGTGGAAGG-3′，下游5′-TTAGGGTAGTGGTAGAAGGT-3′。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 30 s。擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測 人牙周膜細胞中加入RIPA裂解液，3 000 r/min離心20 min，收集上清BCA蛋白定量，目標蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，滴加鼠抗人ERK1/2、p-ERK1/2單克隆抗體(1∶500)，鼠抗人Runt相關基因2單克隆抗體(1∶1 000)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，滴加HRP標記的鼠抗人IgG(1∶2 000)，室溫靜置2 h，ECL顯色，暗室中顯影、采集圖像并分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究使用SPSS20.0處理，研究資料以均數(shù)±標準差表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 人牙周膜細胞鑒定

傳代培養(yǎng)的人牙周膜細胞呈紡錘形或梭形，細胞核呈規(guī)則的卵圓形，具有成纖維細胞結(jié)構特點。免疫組化染色顯示(圖1)，人牙周膜細胞中可見Vimentin陽性表達，角蛋白陰性表達，提示獲取的細胞源自發(fā)育早期的中胚層。

圖1 免疫組化檢測人牙周膜細胞Vimentin和角蛋白表達A：傳代培養(yǎng)的人牙周膜細胞(100×)；B：Vimentin陽性表達(SP 200×)；C：角蛋白陰性表達(SP 200×)

2.2 牽張應力刺激不同時間時各組ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達

牽張應力刺激不同時間p-ERK1/2蛋白表達水平均明顯提升(P<0.05)，其中以刺激1、3 h時p-ERK1/2蛋白表達水平最高；ERK1/2蛋白表達水平在牽張應力刺激不同時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；牽張應力刺激3、6 h時Runt相關基因2蛋白表達水平明顯提升(P<0.05)，12 h時Runt相關基因2蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。提示牽張應力刺激可激活人牙周膜細胞中的ERK1/2信號通路。見表1，圖2。

表1 牽張應力刺激不同時間ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達

與0 h比較，aP<0.05(n=6)

圖2 ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達變化

2.3 ERK1/2通路抑制劑干預對人牙周膜細胞成骨分化相關基因表達的影響

牽張應力組Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量明顯高于ERK1/2通路抑制劑組、對照組(P<0.05)；Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量在ERK1/2通路抑制劑組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；見表2。

表2 三組人牙周膜細胞中Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量比較

與對照組比較，aP<0.05；與牽張應力組比較，bP<0.05(n=6)

2.4 ERK1/2通路抑制劑干預對ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達的影響

牽張應力組p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白相對表達量明顯高于ERK1/2通路抑制劑組與對照組(P<0.05)；ERK1/2蛋白表達水平在三組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3，圖3。

表3 人牙周膜細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白相對表達量比較

與對照組比較，aP<0.05；與牽張應力組比較，bP<0.05(n=6)

圖3 各組ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達的Western blot電泳圖1：對照組；2：牽張應力組；3：ERK1/2通路抑制劑

2.5 牽張應力刺激對人牙周膜細胞成骨分化相關基因表達的影響

空載體轉(zhuǎn)染牽張應力組Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染牽張應力組(P<0.05)；Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量在空載體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染牽張應力組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；見表4。

表4 人牙周膜細胞中Runt相關基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量比較

與空載體轉(zhuǎn)染靜止組比較，aP<0.05；與突變體轉(zhuǎn)染靜止組比較，bP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染牽張應力組比較，cP<0.05(n=6)

2.6 牽張應力刺激對ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達的影響

空載體轉(zhuǎn)染牽張應力組p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白相對表達量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染牽張應力組(P<0.05)；ERK1/2蛋白表達水平在4組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5，圖4。

表5 人牙周膜細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白相對表達量比較

與空載體轉(zhuǎn)染靜止組比較，aP<0.05；與突變體轉(zhuǎn)染靜止組比較，bP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染牽張應力組比較，cP<0.05(n=6)

圖4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關基因2蛋白表達變化1：空載體轉(zhuǎn)染靜止組；2：突變體轉(zhuǎn)染靜止組；3：空載體轉(zhuǎn)染牽張應力組；4：突變體轉(zhuǎn)染牽張應力組

3 討 論

機械力刺激在牙周組織改建中發(fā)揮重要作用[7]。人牙周膜細胞具有成骨細胞表型特征，在一定條件下具有誘導礦化能力，能夠形成礦化小結(jié)和礦化的胞外基質(zhì)[8]。人牙周膜細胞是牙周膜的重要組成成分，可將外界機械力刺激信號轉(zhuǎn)化為生物信號[9-10]。機械力刺激信號傳導是目前研究熱點之一，細胞感受力學信號主要通過以下途徑：①細胞膜表面蛋白質(zhì)在機械力刺激信號的作用下，空間構象發(fā)生改變，位于細胞膜表面的鈣離子通道、黏附蛋白等被激活，出現(xiàn)級聯(lián)反應，向下游逐級傳遞信號[11]；②細胞骨架受機械力刺激信號的影響發(fā)生改變，導骨架中的張力重新分布，促使機械力信號向化學信號的轉(zhuǎn)變[12]。目前研究認為，細胞種類與機械力刺激類型是細胞內(nèi)傳遞力學信號方式的主要決定因素。

絲裂原活化蛋白激酶是分布于細胞質(zhì)中，具有絲氨酸、酪氨酸磷酸化活性[13-14]。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶的主要成員，在機械力刺激信號的傳導過程中發(fā)揮重要作用[15]。相關研究顯示，機械力刺激信號可經(jīng)鈣離子通道與整聯(lián)蛋白途徑活化ERK1/2信號通路，促進成骨細胞分化[16-17]。本研究顯示，牽張應力組p-ERK1/2蛋白表達水平明顯高于對照組，以應力加載系統(tǒng)刺激1、3 h時最為明顯；提示人牙周膜細胞在牽張應力刺激下ERK1/2信號通路被激活。

為進一步探討ERK1/2表達對人牙周膜細胞成骨分化的影響，本研究分別使用ERK1/2通路抑制劑PD98059、ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染來抑制ERK1/2信號通路活化。結(jié)果顯示，牽張應力組成骨細胞表型基因ALP、OCN mRNA表達水平明顯高于對照組，提示機械力刺激能夠繼發(fā)人牙周膜細胞成骨分化的潛力。使用PD98059阻斷后，ALP、OCN mRNA表達水平明顯下調(diào)；且ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染也明顯阻斷了ALP、OCN mRNA表達在牽張應力刺激下的升高；提示ERK1/2信號通路活化介導了牽張應力刺激下人牙周膜細胞的成骨分化。Runt相關基因2是骨發(fā)育和改建的主要調(diào)節(jié)基因，在間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化中發(fā)揮重要作用，且能夠抑制充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化[18-20]。研究者發(fā)現(xiàn)，具有成骨樣特征的人牙周膜細胞中Runt相關基因2是機械力刺激信號的靶蛋白，當受到機械力刺激時可上調(diào)Runt相關基因2的表達[21]。本研究顯示，Runt相關基因2表達水平在應力加載系統(tǒng)刺激1 h時即出現(xiàn)升高，在刺激3 h時達到峰值。給予PD98059阻斷劑和ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染后，Runt相關基因2表達水平明顯下降，提示ERK1/2信號通路參與了Runt相關基因2的調(diào)控過程。

綜上所述，在應力加載系統(tǒng)刺激下，人牙周膜細胞的成骨分化過程中可通過激活ERK1/2信號通路，上調(diào)Runt相關基因2表達，同時促使Runt相關基因2與成骨基因ALP、OCN上的啟動子集合，激活轉(zhuǎn)錄過程。但本實驗是在體外使用周期性牽張應力刺激牙周膜細胞來模擬口腔中牙周膜所受的咬合力，易受到牽張力強度、溫度等多種因素的影響，在今后的研究中應進一步排除外界干擾因素進行深入研究。