劉雨竹，叢 琳，岑思婷，謝春花，牛瑩瑩

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.上海市天平街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200030)

壬基酚(Nonyl Phenol,NP)是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，重要的化工原料之一，廣泛存在于我們的日常生活以及工農(nóng)業(yè)當(dāng)中，排入環(huán)境后很難降解，危害環(huán)境，影響健康[1]。近些年來，壬基酚在大多數(shù)水體中都可檢出，NP 毒性隨水溶性的降低而增大，通過食物鏈蓄積作用進(jìn)入人體[2]?，F(xiàn)已有實驗證明[3]：NP可對生殖、泌尿、免疫等系統(tǒng)產(chǎn)生危害，但對神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究很少。本項目研究不同濃度壬基酚染毒對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、腦組織脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步研究壬基酚對腦組織的損傷作用及機(jī)制提供科學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器設(shè)備超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-1)，丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1)，過氧化氫酶(CAT)試劑盒(A007-1)，單胺氧化酶(MAO)試劑盒(A034)，均購于南京建成生物工程研究所，壬基酚純度大于99%(Adamas公司)；電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器廠)、L500臺式低速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、紫外-可見分光光度計(日本島津公司生產(chǎn)，型號UV-2501PC)等。

1.2 實驗動物及分組選擇健康的SD大鼠，牡丹江醫(yī)學(xué)院動物中心提供，雌雄各半，共32只，體重220～280g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，根據(jù)體重進(jìn)行隨機(jī)分組，分為高、中、低劑量組和空白對照組，每組8只，飼養(yǎng)條件：室溫22～24℃、濕度40%～70%，自由進(jìn)食、飲水。壬基酚用玉米油做溶媒，按照200、100、50mg/(kg·d)的劑量灌胃染毒[4]，對照組給予等量的玉米油，按體重1mL/100g壬基酚灌胃，每日一次，連續(xù)灌胃15d。

1.3 學(xué)習(xí)記憶能力測定采用自制迷宮進(jìn)行空間探索實驗，適度引誘大鼠走出迷宮，訓(xùn)練5min后，記錄大鼠獨(dú)立找到迷宮出口的時間，即為尋找迷宮出口時間[5-6]；將大鼠放置于避暗測試箱內(nèi)，當(dāng)其進(jìn)入暗室即給予針刺，訓(xùn)練5min后測試大鼠從明室第一次進(jìn)入暗室的時間，即為避暗潛伏時間。

1.4 組織取材及勻漿制備末次染毒后24h后斷頭處死，快速取大鼠腦組織，生理鹽水洗凈血污，濾干稱重，計算臟器系數(shù)，腦臟器系數(shù)=腦質(zhì)量(mg)/體重(g)。稱取0.1g腦組織加9倍的生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，3500r/min，離心15min，取上清液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定檢測前將待測腦組織勻漿液用考馬斯亮藍(lán)標(biāo)定蛋白濃度，運(yùn)用羥胺法測定腦組織SOD活力；硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA含量；可見分光光度法測定CAT活性；紫外比色法測定MAO活性；操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用Excel2007建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，通過單因素方差分析進(jìn)行組間比較，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠一般情況空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光滑有光澤，行為敏捷，進(jìn)食、飲水無異樣。壬基酚染毒組出現(xiàn)對外界環(huán)境敏感，易激惹，皮毛發(fā)黃毛糙等現(xiàn)象。實驗前后各組大鼠體質(zhì)量以及腦臟器系數(shù)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

2.2 壬基酚染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響高劑量組大鼠比空白對照組、低、中劑量組尋找迷宮出口時間延長、避暗潛伏時間縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表1 壬基酚染毒對大鼠實驗前、后體質(zhì)量

表2 壬基酚染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

注：與空白對照比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，&P<0.05。

2.3 壬基酚染毒對大鼠腦組織生化指標(biāo)的影響中、高劑量壬基酚染毒組大鼠比空白對照組和低劑量組SOD活力降低、MDA含量升高、CAT活性降低(P<0.05)；低、中、高劑量壬基酚染毒組大鼠比空白對照組MAO活性增強(qiáng)(P值為0.009、0.004、0.000)；高劑量組大鼠比低劑量組SOD活力降低、MDA含量升高、MAO活性增強(qiáng)、CAT活性降低(P<0.05)，詳見表3。

表3 壬基酚染毒對大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05

3 討論

世界衛(wèi)生組織全球疾病研究組曾在2010年的報告中提到，環(huán)境污染物已經(jīng)成為影響人類健康并導(dǎo)致死亡的第四位風(fēng)險因素[7]。2008年歐盟列出13種重要環(huán)境污染物，壬基酚便是其中之一。它主要應(yīng)用于潤滑油添加劑，紡織染料、輔助紙、橡膠、石油等行業(yè)，通過廢水排放到環(huán)境當(dāng)中，可通過食物鏈進(jìn)入人體并逐漸蓄積，而造成全身多系統(tǒng)的損傷[8]。根據(jù)應(yīng)鋒[9]的實驗可知，NP在腦組織存在明顯分布，含量可隨時間不斷增加，滯留時間較長，可通過血腦屏障作用于腦組織。嚴(yán)文霞等人[10]對大鼠接觸壬基酚后的神經(jīng)行為進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)壬基酚染毒可使大鼠出現(xiàn)焦慮、抑郁行為。毛縝[11]等人通過Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)高劑量 NP 染毒小鼠難以在新環(huán)境中適應(yīng)，學(xué)習(xí)記憶能力變差。本實驗通過迷宮實驗和避暗實驗對各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：壬基酚高劑量染毒組大鼠比其他組尋找出口時間延長，避暗潛時間縮短，提示200mg/kg·d壬基酚染毒可以影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與NP可以使腦組織損傷，干擾大腦正常功能有關(guān)。

目前，脂質(zhì)過氧化是腦組織損傷重點(diǎn)研究的毒理機(jī)制之一。有文獻(xiàn)報道中樞神經(jīng)系統(tǒng)對壬基酚更為敏感，更易受到干擾，導(dǎo)致腦組織脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)[11]。MAO等[12]對小鼠進(jìn)行長達(dá)90d的NP染毒，發(fā)現(xiàn)NP可降低腦內(nèi)SOD、CAT，谷胱甘肽過氧化酶和谷胱甘肽還原酶活性，MDA含量升高。從李宏輝等人[13]的實驗可知壬基酚染毒后雄性小鼠腦組織可產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，SOD活性降低，MDA含量增多，MAO的活性提高。本實驗結(jié)果顯示，高劑量壬基酚染毒組的大鼠腦組織中的SOD、CAT活性降低、MAO活性升高，MDA含量升高。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的酶，在其作用下，超氧陰離子與氫離子反應(yīng)生成過氧化氫，可由CAT分解成水[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，當(dāng)體內(nèi)抗氧化能力減弱時，可大量生成。MAO可以激活神經(jīng)毒素或提高體內(nèi)過氧化氫水平對神經(jīng)產(chǎn)生毒害[15]。高劑量的NP可對腦組織中羥自由基有抑制作用，降低清除自由基的SOD的活性，使氧自由基廣泛存在于腦組織中，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA的含量升高，NP的毒性作用使腦組織中MAO的活性的提高，CAT活性的降低，促進(jìn)H2O2生成、積累，最終造成腦組織出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化損傷。

綜上所述，高劑量壬基酚染毒可干擾大鼠正常的學(xué)習(xí)記憶能力，同時可以降低大鼠腦組織中SOD活性、升高M(jìn)DA含量，增強(qiáng)MAO活性，抑制CAT活性，導(dǎo)致大鼠腦組織出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化損傷；學(xué)習(xí)記憶能力的影響可能與大鼠腦組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步實驗研究探索。