劉慧穎 韓玉燕 蔣潤枝 程立寶

摘要：利用不同濃度蔗糖、葡萄糖、果糖溶液處理蓮藕實(shí)生苗，研究不同糖處理對蓮藕實(shí)生苗不定根形成和過氧化物酶（POD）活性的影響。結(jié)果表明10、20、30 g/L蔗糖處理的實(shí)生苗均能促進(jìn)蓮藕不定根的形成，而50 g/L的蔗糖具有明顯的抑制作用。利用10、20、30 g/L葡萄糖處理的蓮藕實(shí)生苗與對照相比無明顯變化，40 g/L和50 g/L的葡萄糖對不定根發(fā)生起明顯抑制作用。利用10、20、30、40、50 g/L的果糖處理蓮藕實(shí)生苗，前期與對照相比無明顯變化，后期隨著果糖溶液濃度的升高，對不定根的形成具有抑制作用。利用不同濃度蔗糖處理蓮藕實(shí)生苗，觀察POD活性的變化，結(jié)果表明不同濃度蔗糖處理過的蓮藕實(shí)生苗POD活性在0～8 d均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。總之，不同類型的糖影響蓮藕實(shí)生苗不定根的形成效果不同，這為進(jìn)一步挖掘調(diào)控蓮藕不定根形成的機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：糖類;蓮藕;不定根;過氧化物酶;實(shí)生苗

中圖分類號： S645.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0155-04

收稿日期：2019-01-16

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（18）3066];江蘇省和揚(yáng)州大學(xué)“研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程”項(xiàng)目（編號：XSJCX18_070）。

作者簡介：劉慧穎（1994—），女，江蘇泰州人，碩士研究生，主要從事蓮藕生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究。

通信作者：程立寶，博士，副教授，主要從事蔬菜遺傳育種與分子生物學(xué)。

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）是睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬多年生水生草本植物[1]，種質(zhì)資源豐富[2]。原產(chǎn)于印度，后來引入中國，是我國栽培面積最大的水生蔬菜[3]。以膨大根狀莖（俗稱藕）供食用，且藥用價(jià)值相當(dāng)高，深受廣大人民的喜愛，是我國主要出口創(chuàng)匯型蔬菜之一[4]。蓮藕的根有2種，一種是主根，另一種是不定根。主根是蓮子播種后，由種子的胚根所形成的，但主根不發(fā)達(dá)，不定根直接影響蓮藕植株的生長發(fā)育。蓮藕不定根較多，發(fā)達(dá)的不定根不僅起到固定、支持植物的作用，還能從土壤中吸收植物生長發(fā)育必需的水分和無機(jī)鹽。糖起到提供營養(yǎng)成分和信號分子的雙重作用，且與植物激素作用影響根系生長發(fā)育[5]。

糖類又稱碳水化合物，是多羥基醛或多羥基酮及其縮聚物和某些衍生物的總稱[6]，一般由碳、氫與氧3種元素所組成[7]，是植物體內(nèi)重要的碳源和能源[8]，它不僅參與能量代謝，還調(diào)控植物的生長發(fā)育和生理過程，糖類在種子萌發(fā)、生根、發(fā)育等方面都有舉足輕重的作用[9]。

蔗糖為等量的葡萄糖和果糖結(jié)合而成，是植物體內(nèi)碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕问?，也是光合作用的主要產(chǎn)物，有儲藏、積累和運(yùn)輸糖分的作用。蔗糖在體內(nèi)能被充分氧化分解產(chǎn)生CO2和H2O，并提供能量，是生物重要的碳源和能量提供者，同時(shí)蔗糖是生物細(xì)胞、蛋白質(zhì)等的必需組成成分，因此它在生物的生長發(fā)育、代謝生理和繁殖等過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。葡萄糖易溶于水，是自然界中最為重要且分布最廣的一種單糖，在植物的生長與干物質(zhì)的積累方面具有積極作用[11]，也是新陳代謝中間產(chǎn)物和活細(xì)胞的能量來源，植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖[12]。果糖是葡萄糖的同分異構(gòu)體，它能與葡萄糖結(jié)合生成蔗糖[13]。

過氧化物酶（POD）是活性較高的一種酶，大量存在于植物體內(nèi)，在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，參與呼吸作用和光合作用，同時(shí)與生長素代謝密切相關(guān)[14]。我們前期證明了生長素是蓮藕不定根形成的直接調(diào)控者，所以本試驗(yàn)在研究蔗糖、葡萄糖和果糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了蔗糖處理對蓮藕植株P(guān)OD活性的影響，為進(jìn)一步探究糖及激素調(diào)控蓮藕不定根形成的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為蓮藕品種太空蓮36號，由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院提供。

試驗(yàn)儀器主要有離心機(jī)和酶標(biāo)儀;試劑主要有過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒。

1.2 糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響試驗(yàn)

將蓮藕種子放置于RXZ-300D智能人工氣候箱（浙江寧波東南儀器有限公司制造）中培養(yǎng)，白天溫度設(shè)為30 ℃，夜間溫度設(shè)為24 ℃，濕度設(shè)為70%;待蓮籽充分吸水（2片子葉有裂縫）破殼后，選取長勢相似的實(shí)生苗放置于塑料盒（長22 cm×寬15 cm×高16 cm）中。該試驗(yàn)于2017年10月開展。利用不同濃度的蔗糖、葡萄糖和果糖（表1）處理蓮藕實(shí)生苗3 d后換清水培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50株實(shí)生苗，2 d更換1次清水。

1.3 蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的測定

待蓮藕實(shí)生苗長出不定根之后，統(tǒng)計(jì)根長≥0.5 mm的所有實(shí)生苗不定根數(shù)量，計(jì)算生根率：生根率=生根種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.4 POD活性測定

采用過氧化物酶試劑盒測定樣品中過氧化物酶的活性（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供）。按照提取液體積（mL） ∶組織質(zhì)量（g）為10 ∶1的比例，在1 mL提取液中加入0.1 g混合樣品的，進(jìn)行冰浴勻漿，在4 ℃下10 000 g離心機(jī)上離心10 min，提取上清，放置冰上待測。測定步驟如下：

（1）將酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至470 nm，蒸餾水調(diào)零。

（2）將試劑一、試劑二、試劑三在測定前室溫放置10 min以上，然后進(jìn)行表2所示操作;在96孔板或微量石英比色皿中按順序依次加入表2中試劑，并立即混勻計(jì)時(shí)，在470 nm下記錄30 s和90 s的吸光度D1、D2。

（3）POD活性的計(jì)算。單位定義：在1 mL反應(yīng)體系中 1 g 組織1 min D470 nm變化0.005為1個(gè)酶活力單位。

POD（U/g）=V總×ΔD÷（V樣×m÷V提）÷0.005÷T=4 000×ΔD÷m。

式中：V總為反應(yīng)體系總體積，mL;V樣為加入樣本體積，mL;m為樣本質(zhì)量;V提為加入提取液體積，mL;T為反應(yīng)時(shí)間，min;ΔD=D2-D1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA、Excel分析Duncans法（P<0.05）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.1.1 不同濃度蔗糖處理對蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的影響 利用不同濃度的蔗糖溶液（10、20、30、40、50 g/L）處理蓮藕實(shí)生苗，結(jié)果（圖1）表明，低濃度的蔗糖處理在調(diào)查天數(shù)內(nèi)顯著增加實(shí)生苗不定根數(shù)量，其中20 g/L的蔗糖處理效果顯著好于10、30、40、50 g/L的處理。研究發(fā)現(xiàn)在1～6 d，20 g/L和30 g/L的蔗糖處理蓮藕實(shí)生苗后，不定根形成數(shù)量均顯著高于清水對照，而10 g/L蔗糖處理在前期促進(jìn)作用不明顯，后期促進(jìn)效果逐漸增強(qiáng);40 g/L蔗糖的處理在1～6 d內(nèi)不定根形成的數(shù)量與對照相比無明顯差異，而50 g/L的濃度顯著抑制蓮藕實(shí)生苗不定根的形成。以上結(jié)果表明，低濃度蔗糖促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根的發(fā)生，而高濃度的蔗糖起到抑制作用。

2.1.2 蔗糖對蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響

由表3可見，不同濃度的蔗糖對蓮藕實(shí)生苗生根率的影響不同，與其他濃度的蔗糖處理和對照對比，10 g/L蔗糖溶液處理后實(shí)生苗生根效果最好，在6 d時(shí)生根率已達(dá)97%。20、30、40 g/L蔗糖的處理，在1～6 d時(shí)不定根生根率也顯著高于對照。50 g/L 蔗糖處理實(shí)生苗后，不定根生根率顯著低于對照。上述結(jié)果表明，低濃度的蔗糖加速不定根的形成，而高濃度的蔗糖延緩了不定根的形成過程。

2.2 葡萄糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.2.1 葡萄糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成數(shù)量的影響 由圖2可見，利用同濃度的葡萄糖處理蓮藕實(shí)生苗，在處理后的 1～6 d，10 g/L和20 g/L的處理與對照相比，不定根數(shù)量無明顯變化，40 g/L和50 g/L的葡萄糖顯著抑制了蓮藕不定根形成的數(shù)量。30 g/L葡萄糖的處理在1～4 d時(shí)，與對照相比無顯著變化，在5～6 d時(shí)，不定根形成數(shù)量顯著少于對照。綜上所述，低濃度葡萄糖對蓮藕實(shí)生苗不定根的發(fā)生無明顯作用，而高濃度葡萄糖具有顯著的抑制效果。

2.2.2 不同濃度的葡萄糖對蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響

蓮藕實(shí)生苗在不同濃度葡萄糖處理下，其生根率如表4所示，處理后1～4 d，與對照相比，10、20、30、40 g/L處理下的實(shí)生苗不定根發(fā)生率無明顯變化，而濃度達(dá)到50 g/L時(shí)，不定根的發(fā)生明顯變遲緩。處理后5～6 d，除5 d時(shí)50 g/L處理外，各個(gè)處理和對照之間不定根發(fā)生率差異不顯著。

2.3 果糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.3.1 果糖對蓮藕實(shí)生苗不定根形成數(shù)量的影響

利用10、20、30、40、50 g/L的果糖處理蓮藕實(shí)生苗，研究其對蓮藕實(shí)生苗不定根形成數(shù)量的影響。結(jié)果（圖3）表明：在1～6 d時(shí)，10 g/L 和20 g/L的果糖對蓮藕實(shí)生苗不定根的形成與對照相比無顯著差異。30 g/L和40 g/L的果糖在1～4 d時(shí)與對照相比變化不明顯，在5～6 d時(shí)，不定根數(shù)量顯著低于對照。50 g/L果糖顯著抑制了不定根的發(fā)生，在1～6 d時(shí)不定根數(shù)量明顯低于對照。

2.3.2 果糖對蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響

蓮藕實(shí)生苗在不同濃度果糖處理下生根率的變化如表5所示，10、20、30、40、50 g/L的果糖處理后，生根率在1～2 d時(shí)均高于對照，在3～6 d時(shí)，不同濃度果糖溶液處理過的蓮藕實(shí)生菌不定根生根率與對照相比均無明顯變化。

2.4 蔗糖對蓮藕不定根POD活性的影響

由圖4可知，不同濃度蔗糖處理的蓮藕實(shí)生苗不定根POD活性在0～8 d均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。0 d時(shí)，30 g/L蔗糖處理下的蓮藕實(shí)生苗POD活性最高，與 20 g/L 和40 g/L處理的差異不顯著，但均顯著高于對照。在2 d時(shí)，所有濃度蔗糖處理的實(shí)生苗POD活性均高于對照組，且40 g/L>30 g/L>20 g/L>50 g/L>10 g/L。處理后8 d，10 g/L 和20 g/L的蔗糖處理顯著高于對照及其他處理，其他濃度蔗糖處理之間差異不顯著。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，20 g/L蔗糖溶液能夠顯著提高蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量和生根率，而50 g/L蔗糖對不定根形成的數(shù)量和生根率起到顯著的抑制作用。低濃度的葡萄糖對不定根形成無明顯作用，而高濃度的葡萄糖和果糖顯著抑制了不定根的發(fā)生;低濃度的果糖雖然對不定根數(shù)量沒影響，但加速了不定根的發(fā)生時(shí)間。蔗糖處理后蓮藕實(shí)生苗POD活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。

4 討論

Takahashi等已發(fā)現(xiàn)，蔗糖、葡萄糖和果糖可以明顯促進(jìn)擬南芥下胚軸不定根的發(fā)生[15]。耿貝貝等研究表明低濃度蔗糖（1 g/L）可以誘導(dǎo)黃瓜不定根發(fā)生，而高濃度蔗糖（5～50 g/L）則不同程度抑制不定根的發(fā)生[16]。本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。胡江琴等報(bào)道高于5 g/L的蔗糖（20～120 g/L）對綠豆下胚軸不定根發(fā)生有不同程度的抑制作用[17];但在丹參上觀察到高濃度蔗糖（60 g/L）反而有利于不定根生長[18]。黃韜等在對人參不定根培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)40 g/L的蔗糖最有益于人參不定根的生長，當(dāng)蔗糖濃度比較低時(shí)，不定根的生長狀態(tài)較差，高濃度的蔗糖卻對不定根的生長有一定的促進(jìn)作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度蔗糖（10～30 g/L）可以誘導(dǎo)蓮藕不定根形成，而高濃度蔗糖（40～50 g/L）則不同程度抑制了不定根的發(fā)生。葡萄糖和果糖在低濃度（10～30 g/L）無營養(yǎng)條件下對蓮藕不定根的形成數(shù)量無明顯影響，高濃度起抑制作用（40～50 g/L）。本試驗(yàn)結(jié)果與耿貝貝等人試驗(yàn)結(jié)果相似，與黃韜等人研究結(jié)果有出入，說明不同類型的糖對不同物種的作用可能不同。

POD參與了植物生長發(fā)育的全過程，隨著物種種類和生長發(fā)育階段等不同，POD活性會發(fā)生變化。韓晴在對槐種子發(fā)育過程的研究中發(fā)現(xiàn)，在花后60～90 d，種子葉細(xì)胞過氧化物酶活性從低到高，然后又呈現(xiàn)降低的變化趨勢[20]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似，我們利用蔗糖處理蓮藕實(shí)生苗，發(fā)現(xiàn)在0～8 d內(nèi)POD活性呈現(xiàn)先下降后上升再降低的規(guī)律，說明蓮藕實(shí)生苗不定根POD活性可能與蔗糖濃度有關(guān)。研究表明生長素調(diào)控了蓮藕不定根的形成[21]，而POD活性與生長素代謝密切相關(guān)，所以過氧化物酶可能通過影響蓮藕實(shí)生苗中生長素含量，進(jìn)而影響不定根的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊蒙立. 乙烯和生長素調(diào)控蓮藕實(shí)生苗不定根形成的機(jī)制[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2016.

[2]張新忠，陳宗懋，趙梅勤，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蓮藕、蓮葉、蓮子、田泥與田水中12種農(nóng)藥殘留[J]. 分析測試學(xué)報(bào)，2018，37（10）：1221-1229.

[3]康書靜，錢 前，朱 麗. 生長素對水稻根系生長發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 中國稻米，2014，20（4）：1-8.

[4]路志芳，袁 超，郝貴增，等.蓮藕淀粉的特性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（15）：157-160.

[5]李慧敏，梁永書，南文斌，等. 糖調(diào)控植物根系生長發(fā)育的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（14）：108-113.

[6]Williams L E，Lemoine R，Sauer N. Sugar transporters in higher plants：adversity of roles and complex regulation[J]. TrendsPlantSci，2000，5（7）：283-290.

[7]Coruzzi G，Bush D R. Nitrogen and carbon nutrient and metabolite signaling in plants[J]. Plant Physiol，2001，125：61-64.

[8]Finkelstein R R，Gibson S I. ABA and sugar interactions regulating development：cross-talk or voice sina crowd？[J]. Curr Opin PlantBiol，2001，5：26-32.

[9]黃 弈，支添添，任春梅. 不同糖對擬南芥種子萌發(fā)和sscd1突變體細(xì)胞死亡的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（23）：93-95.

[10]蔣潤枝，馬翠亭，馮先楚，等. 激素和葉面剪除對蓮藕實(shí)生苗不定根形成及POD活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（13）：142-146.

[11]郎冬梅，秦嗣軍，朱紫檀，等. 外源葡萄糖對山定子生長及根系氮素代謝的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2018，29（3）：797-804.

[12]張 碩，黃豫謙，張飛雄. 蔗糖對小麥根生長和形態(tài)學(xué)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（35）：16987-16988.

[13]王 治. 糖對擬南芥幼苗初生根生長影響的研究[D]. 北京：中央民族大學(xué)，2011.

[14]孫姍姍. 水分脅迫下糖類浸種對玉米萌發(fā)及根際微生物的影響[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[15]Takahashi F，Sato-Nara K，Kobayashi K，et al. Sugar-induced adventitious roots in Arabidopsis seedlings[J]. J Plant Res，2003，116：83-91.

[16]耿貝貝，郭 強(qiáng)，師 慈，等. 低濃度蔗糖對黃瓜下胚軸不定根發(fā)生有誘導(dǎo)作用[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（3）：157-159.

[17]胡江琴，王利琳，龐基良，等. 綠豆下胚軸正反插條件下無機(jī)鹽和蔗糖對下胚軸不定根發(fā)生的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊，2002（3）：228-230.

[18]Teo Y H，Beyrouty C A，Norman R J，et al. Nutrient up take relationship to root characteristics of rice[J]. Plant and Soil，1995，171（2）：97-302.

[19]Kwak K S，Iijima M，Yamauchi A，et al. Carbon and nitrogen dynamics with aging in seminal root system of rice seedling[J]. Crop Science，1995，64（3）：629-635.

[20]韓 晴，馮建嶺，韓 浩，等. 茄子過氧化物酶的特性研究[J]. 山東食品發(fā)酵，2014（2）：7-12.

[21]Cheng L B，Jiang R Z，Yang J J，et al. Transcriptome profiling reveals an IAA-regulated response to adventitious root formation in lotus seedling[J]. Zeitschrift für Naturforschung C，2018，73：229-240.