張蓓蕾，吳 濤，姜 鋒，李艷紅,王 福，李 怡

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710038；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院普外科，陜西 西安 710038；3.西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710071)

MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼的約22個(gè)核苷酸的小RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA通過(guò)與其靶mRNA序列的3′TR完全或不完全的堿基配對(duì)，導(dǎo)致miRNA降解或翻譯抑制各種各樣的生命過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、代謝和致癌作用[1]。miRNA在多種癌癥中可特異表達(dá)，一些過(guò)表達(dá)的miRNA起著致癌基因作用，一些表達(dá)下調(diào)的miRNA起著抑癌基因的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p在上皮性卵巢組織中呈顯著性差異表達(dá)，提示miR-129-5p在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[3]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化的作用下，DNA上的某些序列的胞嘧啶的第5位碳原子上被加上一個(gè)甲基基團(tuán)，變成5-甲基胞嘧啶[4]。甲基化可以通過(guò)去甲基化藥物，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-dC)來(lái)逆轉(zhuǎn)，使基因重新表達(dá)。有研究已發(fā)現(xiàn)在癌癥中，用5-Aza-dC處理后可以降低DNA的甲基化水平[5]。

鑒于miRNA在多種生物過(guò)程中的重要作用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多方法來(lái)檢測(cè)miRNA的表達(dá)，例如Northern雜交、實(shí)時(shí)PCR和微陣列。然而，這些常規(guī)方法通常需要裂解或固定細(xì)胞，不能在體反映miRNA的活性[6]。以熒光蛋白、熒光素酶或分子信標(biāo)等作為分子探針的分子影像技術(shù)為研究活體內(nèi)基因的特異性表達(dá)提供了一種新的檢測(cè)手段。在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種酪氨酸酶報(bào)告基因來(lái)監(jiān)測(cè)卵巢癌中miR-129-5p的表達(dá)。酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是負(fù)責(zé)黑色素生產(chǎn)的主要酶，可以提供很強(qiáng)的光聲成像的吸收對(duì)比度。我們通過(guò)黑色素體內(nèi)外含量、酪氨酸酶活性、光聲信號(hào)證明了酪氨酸酶報(bào)告基因監(jiān)測(cè)miR-129-5p表達(dá)活性的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

酪氨酸酶TYR基因(NM_000372)質(zhì)粒GV140-TYR購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司；卵巢癌細(xì)胞SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，并培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、100mg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素(invitrogen，CA)；miRNA-129-5p寡核苷酸購(gòu)自上海吉碼公司；一步法cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；L-酪氨酸、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)、5-Aza-dC全部購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 TYR和TYR-3xTS報(bào)告基因的構(gòu)建

以質(zhì)粒GV140-TYR為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增TYR DNA，將TYR cDNA插入到pcDNA 3.1(+)載體的NheⅠ和BamH Ⅰ多克隆位點(diǎn)得到pcDNA3.1-TYR報(bào)告基因。為得到pcDNA3.1-TYR-3xTS報(bào)告基因，我們合成了一種與miR-129-5p 完全互補(bǔ)配對(duì)的靶序列(3xTS)，并將其插入到pcDNA3.1-TYR載體的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ位點(diǎn)。最后，通過(guò)DNA測(cè)序確定了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TYR和pcDNA3.1-TYR-3xTS。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人源293細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)在DMEM、10%胎牛血清和1U/mL青霉素/鏈霉素培養(yǎng)基中，并置于37°C下5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。對(duì)于轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞接種在24孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，采用Lipofectamine 2000對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1-TYR、pcDNA3.1-TYR-3xTS和miRNA-129-5p寡核苷酸共轉(zhuǎn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR

用TRIzol試劑從細(xì)胞中分離提取總RNA。采用一步法cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA合成，然后使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒在ABI 7700 PCR儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。U6小核RNA(snRNA)用作內(nèi)參。miRNA-129-5p和U6 snRNA引物序列如下：miRNA-9引物上游序列為5′-TCT TTG GTT ATC TAG CTG TAT GA-3′；U6上游序列為5′-CAG GGG CCA TGC TAA ATC TTC-3′；U6反向序列為5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC TAA AAT-3′。miRNA-129-5p反向引物是試劑盒中的通用引物(Uni-miR qPCR引物)。

1.2.4 細(xì)胞黑色素含量測(cè)量

將細(xì)胞用2mmol/L L-酪氨酸預(yù)處理24h，然后離心分離并用PBS洗滌3次。將細(xì)胞沉淀物進(jìn)行超聲處理并用100mL NaOH(1mol/L)在37℃下裂解，然后將細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移到96孔板，每個(gè)樣品的黑色素含量是采用多功能酶標(biāo)儀采集它們?cè)?05nm處的吸光度測(cè)定。

1.2.5 細(xì)胞TYR活性測(cè)量

采用PBS洗滌96孔板中的細(xì)胞，并用50μL NaOH(1mol/L)裂解，然后加50μL 2mg/mL的L-DOPA到每個(gè)孔。將最終混合物在37℃下保溫15min，采集它們?cè)?75nm處的吸光度。

1.2.6 體外細(xì)胞光聲成像和圖像分析

使用多光譜光聲成像系統(tǒng)進(jìn)行體外光聲成像測(cè)定。轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒或RNA的細(xì)胞收集在PCR管中，然后使用手持式光聲成像探頭獲取光聲在PCR管底部發(fā)出的信號(hào)，光聲信號(hào)最終被超分辨率小動(dòng)物光聲成像系統(tǒng)(型號(hào)：MOST invision 128)收集。

1.2.7 小鼠在體光聲和生物發(fā)光成像

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作嚴(yán)格依照空軍軍醫(yī)大學(xué)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。實(shí)驗(yàn)裸鼠(約4周)購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將SKOV3卵巢癌細(xì)胞重懸于100mL PBS中，然后將SKOV3細(xì)胞和100mL基質(zhì)膠(matrigel)植入小鼠的兩側(cè)。小鼠右側(cè)用5-Aza-dC(2mg/kg)處理，左側(cè)不處理。72h后，體內(nèi)成像時(shí)，用2%異氟烷氣體麻醉小鼠。光聲成像采用和體外成像相同的方法進(jìn)行。生物發(fā)光成像時(shí)，將D-熒光素(150mg/kg)腹腔注射入小鼠體內(nèi)，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(型號(hào)：IVIS spectrum)成像。選定感興趣區(qū)進(jìn)行圖像分析，使用Image J軟件對(duì)光聲信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析或使用Living Imaging Software 4.1分析生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基于TYR報(bào)告基因的miRNA成像系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

如圖1所示，將與miR-129-5p完全互補(bǔ)配對(duì)的靶序列(3xTS)插入TYR載體的3′TR中，產(chǎn)生CMV/TYR-3xTS報(bào)告基因。同時(shí)，不包含3xTS的CMV/TYR報(bào)告基因作為對(duì)照。通過(guò)轉(zhuǎn)染將CMV/TYR-3xTS報(bào)告基因?qū)爰?xì)胞，表達(dá)的TYR將催化黑色素合成，得到的基因產(chǎn)物黑色素可以作為光聲成像的靶標(biāo)。如果不存在miR-129-5p，細(xì)胞中的TYR將正常表達(dá)。相反，當(dāng)內(nèi)源產(chǎn)生或外源miR-129-5p在細(xì)胞中表達(dá)，miR-129-5p將與CMV/TYR-3xTS報(bào)告基因的3xTS結(jié)合，抑制TYR活性和黑色素生成，進(jìn)而通過(guò)光聲成像系統(tǒng)檢測(cè)到的光聲信號(hào)減少。

圖1 基于酪氨酸酶的報(bào)告基因系統(tǒng)示意圖

2.2 報(bào)告基因系統(tǒng)的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證基于TYR的報(bào)告基因系統(tǒng)，向非黑色素細(xì)胞HEK293細(xì)胞(其miR-129-5p表達(dá)相對(duì)較低)轉(zhuǎn)染了CMV/TYR質(zhì)?；駽MV/TYR-3xTS質(zhì)粒，或?qū)①|(zhì)粒與miR-129-5p RNA共轉(zhuǎn)染，觀察它們的顏色和黑色素含量，如圖2A中上排的圖片所示，CMV/TYR轉(zhuǎn)染或CMV/TYR-3xTS和NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈現(xiàn)深色，而CMV/TYR-3xTS和miR-129-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或293未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示淺色，表明外源miR-129-5p與CMV/TYR-3xTS的3xTS結(jié)合并抑制了TYR基因的表達(dá)。隨后，采用L-酪氨酸(2mmol/L)處理CMV/TYR或CMV/TYR-3xTS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，24h后它們的顏色顯著增強(qiáng)，但是293未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒(méi)有明顯變化(見(jiàn)圖2A中下排的圖片)。為了量化分析這些細(xì)胞中的黑色素含量，在405nm處測(cè)其吸光度。除了293未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，L-酪氨酸在處理過(guò)細(xì)胞后，黑色素的產(chǎn)生都增加了(見(jiàn)圖2B)。評(píng)估轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的酪氨酸酶活性，結(jié)果表明CMV/TYR轉(zhuǎn)染或CMV/TYR-3xTS和NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞隨著時(shí)間的推移酪氨酸酶活性增加，并且顯著高于293未轉(zhuǎn)染細(xì)胞或CMV/TYR-3xTS和miR-129-5p共轉(zhuǎn)染組,在8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)增加約1.8倍(見(jiàn)圖2C)。

2.3 基于TYR的報(bào)告基因?qū)iR-129-5p成像的特異性

為了研究TYR的報(bào)告基因的特異性，轉(zhuǎn)染不同量(0、1、2、4μg)的CMV/TYR或CMV/TYR-3xTS質(zhì)粒進(jìn)入293細(xì)胞，然后收集細(xì)胞，檢查它們的顏色和黑色素含量。將逐漸增加的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后，顏色(見(jiàn)圖3A)和黑色素產(chǎn)生(見(jiàn)圖3B)明顯逐漸增加。此外，通過(guò)檢測(cè)在475nm處的吸收值，兩轉(zhuǎn)染組的TYR活性也是以劑量依賴(lài)性方式增加(見(jiàn)圖3C)。然后我們檢測(cè)細(xì)胞樣品的光聲信號(hào)，定量分析表明光聲信號(hào)是根據(jù)CMV/TYR-3xTS質(zhì)粒的增加而增加的，最終約增加4.6倍(見(jiàn)圖3D)。

注：A為293細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后，收集細(xì)胞進(jìn)行拍照；B為黑色素含量的測(cè)定；C為酪氨酸酶活性的測(cè)定；*P<0.05。

注：A為293細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度的質(zhì)粒后，收集細(xì)胞進(jìn)行拍照；B為黑色素含量的測(cè)定；C為酪氨酸酶活性的測(cè)定；D為細(xì)胞樣品的光聲成像。*P<0.05,**P<0.01。

圖3基于TYR報(bào)告基因的劑量-表達(dá)評(píng)估

Fig.3 Dose-Response Assessment of the TYR-Based Reporter Gene

相比之下，隨著外源轉(zhuǎn)染的miR-129-5p(0、5、10、20、40nmol/L)濃度的增加和固定量(4μg)的CMV/TYR-3xTS質(zhì)粒導(dǎo)入293細(xì)胞中，細(xì)胞顏色越來(lái)越淺(見(jiàn)圖4A)。此外，還觀察到黑色素含量明顯逐漸減少(見(jiàn)圖4B)，酪氨酸酶TYR活性(見(jiàn)圖4C)和光聲強(qiáng)度(見(jiàn)圖4D)明顯降低，表明外源導(dǎo)入的miR-129-5p與CMV/TYR-3xTS報(bào)告基因作用導(dǎo)致了TYR基因的翻譯抑制，因此TYR的活性受到抑制。

注：A為293細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-129-5p后，收集細(xì)胞進(jìn)行拍照；B為黑色素含量的測(cè)定；C為酪氨酸酶活性的測(cè)定；D為細(xì)胞樣品的光聲成像。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

圖4TYR對(duì)外源miR-129-5p的抑制活性

Fig.4 Repressed Activity of TYR in Response to Exogenous miR-129-5p

2.4 在DNA甲基化調(diào)控作用下監(jiān)測(cè)內(nèi)源性miR-129-5p表達(dá)

為了監(jiān)測(cè)DNA甲基化期間內(nèi)源miR-129-5p的表達(dá)，將CMV/TYR-3xTS轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3，并進(jìn)一步用不同濃度(0、0.5、1.0、2.0μmol/L)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC處理細(xì)胞72h。結(jié)果顯示隨著5-Aza-dC劑量的增加，細(xì)胞顏色逐漸變淺(見(jiàn)圖5A)。此外，隨著不同劑量的5-Aza-dC處理后，黑色素含量(見(jiàn)圖5B)、TYR活性(見(jiàn)圖5C)和光聲信號(hào)(見(jiàn)圖5D)也逐漸減少。這些減少可能歸因于5-Aza-dC激活了內(nèi)源性miR-129-5p的產(chǎn)生，從而抑制TYR活性。為了證實(shí)我們的推測(cè)，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)以確定5-Aza-dC處理后細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)水平。同預(yù)期的一樣，隨著5-Aza-dC劑量的增加，miR-129-5p表達(dá)水平隨劑量逐漸上調(diào)(見(jiàn)圖5E)。

注：A為不同濃度的5-Aza-dC處理SKOV3細(xì)胞后，收集細(xì)胞進(jìn)行拍照；B為黑色素含量的測(cè)定；C為酪氨酸酶活性的測(cè)定；D為細(xì)胞樣品的光聲成像；E為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-129-5p的表達(dá)。*P<0.05,**P<0.01。

圖5監(jiān)測(cè)用5-Aza-dC處理后的內(nèi)源性miR-129-5p

Fig.5 Monitor Endogenous miR-129-5p Exposure to 5-Aza-dC Treatment

2.5 miR-129-5p的動(dòng)物光聲成像

為了采用基于TYR的報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)表觀遺傳調(diào)控過(guò)程中miR-129-5p的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，我們共轉(zhuǎn)染CMV/TYR-3xTS和內(nèi)參質(zhì)粒pGL3-control進(jìn)入卵巢癌細(xì)胞SKOV3，然后收集5×106個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，皮下植入裸鼠兩側(cè)，其中用5-Aza-dC處理右側(cè)細(xì)胞。在處理3天后，如圖6A所示，用5-Aza-dC處理的小鼠右側(cè)翼的光聲信號(hào)顯著降低。對(duì)感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)定量分析表明來(lái)自右側(cè)的光聲強(qiáng)度比左側(cè)的強(qiáng)度低1.54倍(見(jiàn)圖6B)。相比之下，在5-Aza-dC處理后、內(nèi)參pGL3-control，都會(huì)表達(dá)熒光素酶，小鼠左右側(cè)翼之間沒(méi)有明顯的的信號(hào)變化(見(jiàn)圖6C、圖6D)。為了確認(rèn)光聲信號(hào)的減少是由于體內(nèi)miR-129-5p的激活，我們分離了來(lái)自小鼠兩側(cè)的組織并對(duì)miR-129-5p表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析(見(jiàn)圖6E)。結(jié)果表明，來(lái)自小鼠右側(cè)的miR-129-5p表達(dá)水平比左側(cè)高約3.2倍，表明miR-129-5p在5-Aza-dC處理后被激活，從而導(dǎo)致光聲信號(hào)減少。

注：A為小鼠光聲成像；B為光聲成像定量分析；C為小鼠生物發(fā)光成像；D為生物發(fā)光成像定量分析；E為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-129-5p的表達(dá)。*P<0.05。

圖6表觀遺傳調(diào)控下miR-129-5p的體內(nèi)成像

Fig.6 In Vivo Imaging of miR-129-5p during Epigenetic Gene Regulation

3 討論

在本研究中，我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)成功地證明了使用酪氨酸酶報(bào)告基因和光聲成像來(lái)監(jiān)測(cè)miR-129-5p表達(dá)變化的可行性。由于miRNA在調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程中(包括細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展)有非常重要的作用，基于酪氨酸酶報(bào)告基因的光聲成像檢測(cè)，將是一種有用的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miRNA表達(dá)的工具。

3.1 酪氨酸酶是一種優(yōu)良的光聲成像探針

光聲成像是一種新興的分子成像模式，能夠產(chǎn)生比現(xiàn)有光學(xué)成像模式更高空間分辨率(在組織穿透深度約5cm時(shí)高達(dá)500mm)的體內(nèi)3D圖像[7]。這種非侵入性成像模態(tài)背后的物理機(jī)制是光聲效應(yīng)(即從光到超聲的轉(zhuǎn)換)。光聲成像還可以使用內(nèi)源性或外源性光聲造影劑實(shí)時(shí)提供疾病的功能和分子信息[8-9]。因此非常需要開(kāi)發(fā)用于光聲成像的新成像探針。黑色素具有寬的光學(xué)吸收光譜，在近紅外波長(zhǎng)處具有顯著的吸收，這能提供良好的組織穿透深度[10-11]。由于這種獨(dú)特的性質(zhì)，黑色素已被證明是光聲成像優(yōu)良的內(nèi)源造影劑[12-14]。鑒于酪氨酸酶可調(diào)控黑色素的合成，因此我們探索了使用酪氨酸酶作為光聲成像的報(bào)告基因。本研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了酪氨酸酶報(bào)告基因后，293細(xì)胞中的黑色素含量和酪氨酸酶活性顯著增加，且隨著質(zhì)粒濃度及作用時(shí)間的增加而逐漸增加，并且細(xì)胞中的光聲信號(hào)也呈濃度梯度依賴(lài)性增強(qiáng)。結(jié)果表明，酪氨酸酶報(bào)告基因可成功用于光聲成像。

3.2 酪氨酸酶報(bào)告基因成功監(jiān)測(cè)miRNA的表達(dá)

目前，有報(bào)道各種熒光探針用于監(jiān)測(cè)miRNA在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[15-16]。盡管這些光學(xué)探針為miRNA成像提供了很好的表達(dá)方式，但是它們?cè)谏疃瘸上穹矫媸艿綐O大的影響。此外，由于外部光源激發(fā)，熒光探針通常具有自發(fā)熒光背景，在活體動(dòng)物中成像常受背景干擾[17-18]。因此，需要開(kāi)發(fā)新型的分子探針來(lái)無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)miRNA的表達(dá)。本研究中，我們通過(guò)將與miR-129-5p完全互補(bǔ)配對(duì)的靶序列(3xTS)插入酪氨酸酶基因載體的3′TR中，得到TYR-3xPT報(bào)告基因載體，從而可以無(wú)創(chuàng)地提供有關(guān)miRNA的在體信息。在用5-Aza-dC處理的SKOV3卵巢癌細(xì)胞中，來(lái)自CMV/TYR-3xTS報(bào)告基因的酪氨酸酶活性明顯被劑量增加的miR-129-5p抑制。miR-129-5p調(diào)節(jié)的酪氨酸酶活性抑制，從而導(dǎo)致體外和體內(nèi)黑色素含量和光聲信號(hào)的明顯降低。此外，在5-Aza-dC處理后，皮下裸鼠模型右側(cè)也觀察到光聲信號(hào)的顯著降低，表明miR-129-5p的表達(dá)被5-Aza-dC激活，從而通過(guò)與其靶序列結(jié)合最終抑制酪氨酸酶活性和光聲信號(hào)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果證實(shí)了這一推測(cè)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，基于酪氨酸酶的報(bào)告基因系統(tǒng)CMV/TYR-3xTS可用于監(jiān)測(cè)DNA甲基化調(diào)控過(guò)程中miR-129-5p的表達(dá)，并可作為一種新型的報(bào)告基因系統(tǒng)用于非侵入性地監(jiān)測(cè)生物體中其他miRNA的表達(dá)及miRNA介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程。