王淑蘭，盧娟娟，張惠琴

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病的慢性并發(fā)癥之一是認(rèn)知功能障礙，糖尿病認(rèn)知功能障礙極大地危害了人們的身體健康并嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。2型糖尿病（T2DM）為目前對人類健康最具威脅的疾病之一，葡萄糖是大腦最主要的能量來源，正常情況下，線粒體利用葡萄糖為大腦提供能量，但在高血糖的情況下，線粒體利用葡萄糖產(chǎn)生大量的活性氧自由基，使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激增加，腦細(xì)胞功能受損嚴(yán)重，出現(xiàn)認(rèn)知能力下降[2-4]。2型糖尿病的另一基本特征是胰島素抵抗，無論是胰島素抵抗還是胰島素分泌不足都可以影響腦內(nèi)葡萄糖代謝、腦細(xì)胞滲透壓的改變和神經(jīng)營養(yǎng)不足，從而改變神經(jīng)生理功能，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生胰島素抵抗，胰島素信號通路發(fā)生改變，出現(xiàn)了阿爾茨海默病（AD）特征性的病理變化，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和老年斑的形成。Aβ對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用是使血管壁淀粉樣變直接導(dǎo)致血管硬化，彈性變差，甚至容易破裂或形成血栓，還誘使神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引發(fā)認(rèn)知障礙，因此，防治AD發(fā)病的重要策略之一是抗氧化、抗凋亡。2型糖尿病由于糖利用障礙，引起體內(nèi)大量自由基的形成，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯，引起血流動力學(xué)改變和微血管病變，并使血管動脈硬化明顯，造成血管狹窄，最終引起缺血、缺氧及神經(jīng)損害，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的形成。

研究表明，胰島素不僅具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)新陳代謝、促進(jìn)神經(jīng)元的生長發(fā)育、調(diào)控腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的作用，而且在認(rèn)知等高級智能活動中起到了重要的作用。胰島素在大腦內(nèi)的作用已成為海內(nèi)外研究的熱點，關(guān)注胰島素抵抗與AD的關(guān)系可能為AD的早期防治提供有效的新途徑。

探討胰島素抵抗動物模型腦組織損傷及紅景天保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，揭示AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制并選擇有效的防治靴點提供理論依據(jù)，同時探究天然藥物多效性的特點，從天然藥物寶庫中發(fā)掘有效預(yù)防和治療記憶減退的藥物提供應(yīng)用價值。以往研究證明，紅景天具有抗缺氧、抗炎和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌的作用[4-8]。紅景天的主要單體成分是紅景天苷，紅景天苷能否改善AD所致認(rèn)知和記憶障礙以及其通過哪些機(jī)制發(fā)揮作用的研究報道很少。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性成年SD大鼠，體重250~350 g，從蘭州大學(xué)實驗動物中心購買，該實驗所有的操作及相關(guān)流程遵守蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗委員會的相關(guān)指導(dǎo)準(zhǔn)則。第一周進(jìn)行喂養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境，采用嚙齒類動物飼料的喂食標(biāo)準(zhǔn)，晝夜周期為（8：00—20：00），自由進(jìn)食飲水，室溫（22±2）℃。

1.2 藥物及主要試劑

鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）；紅景天干燥粉末（甘肅省中醫(yī)研究所）；血糖儀（三諾生物傳感技術(shù)有限公司）；血糖儀試紙條（三諾生物傳感技術(shù)有限公司）；大鼠解剖手術(shù)臺（北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）；胰島素試劑盒ELISA（上海博耀生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；Aβ酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司）；1%戊巴比妥鈉（湖北鴻運隆生物科技有限公司）。

1.3 儀器

水迷宮視頻分析系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；低溫離心機(jī)（湖南湘儀實驗室開發(fā)有限公司）。

1.4 給藥方法及分組

24只8周健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，選取8只作為正常對照組（隨機(jī)），嚙齒類動物飼料喂食，其余用高脂高糖高蛋白飼料喂養(yǎng)8周作為T2DM模型組，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（STZ）27 mg/kg制備T2DM模型，30 min內(nèi)注射完畢，正常對照組注射生理鹽水。腹腔注射STZ 3天后，眼底靜脈叢取血和制備血清，測定大鼠空腹血糖（FPG），血清胰島素含量用胰島素ELISA檢測試劑盒測定，采血前禁食14 h，其FPG≥11.1 mmol/L，判斷T2DM模型成功與否，造模成功后，各組大鼠按上述方法繼續(xù)飼養(yǎng)4周，根據(jù)文獻(xiàn)Morris水迷宮實驗檢測大鼠認(rèn)知功能[9]，將存在認(rèn)知功能障礙的T2DM大鼠隨機(jī)分為兩組：AD組、紅景天干預(yù)組，兩組大鼠高糖高脂喂養(yǎng)，同時分別用等體積生理鹽水和紅景天苷（50 mg/kg/d）灌胃處理21天。正常對照組等量生理鹽水灌胃。各組大鼠每天上午10點對其進(jìn)行灌胃，1次/d。

1.5 大鼠的認(rèn)知功能用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)檢測

實驗干預(yù)措施結(jié)束24 h內(nèi)開始Morris水迷宮檢測[10]。水池直徑為160 cm，高50 cm，平臺直徑10 cm，高度30 cm。池壁上有N、E、S、W 4個等距離點，將水池分為4個象限，平臺可放在任意一個象限內(nèi)，平臺置于水面下1 cm，水溫（25.0±1.0）℃，水中加入漂白劑，使水呈乳白色，在實驗期間迷宮外參照物不變。試驗前5天為訓(xùn)練時間，第6天為測試。每天上、下午各訓(xùn)練4次（間隔6 h），相鄰兩次訓(xùn)練時間間隔為1 min。訓(xùn)練時，入水點隨機(jī)選取，將各組大鼠面向池壁放入池中，記錄各組大鼠尋找到平臺并爬上平臺所用時間，即逃避潛伏期，如果大鼠在2 min內(nèi)未能尋找到平臺，須將其人為引至平臺，此時潛伏期記為2 min。于第5天訓(xùn)練結(jié)束后撤除水下平臺，于第6天將大鼠面向池壁于同一入水點放入池中，記錄逃避潛伏期和其在2 min內(nèi)跨越平臺的次數(shù)。

1.6 檢測大鼠海馬組織中活性氧自由基（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）含量

各組大鼠于水迷宮實驗結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動脈取血，分離血清后置于-20℃冰箱中備檢。每組大鼠取血后，立即斷頭取腦，分離海馬進(jìn)行勻漿，取上清液，一部分置-20℃冰箱中備檢，一部分大腦海馬組織用于測定細(xì)胞內(nèi)ROS和SOD含量。超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和活性氧自由基（ROS）檢測試劑盒測定各組大鼠海馬組織內(nèi)SOD和ROS含量，具體實驗方法見產(chǎn)品說明書。

1.7 血清和腦組織β淀粉樣蛋白（Aβ）含量檢測

按ELISA試劑盒操作說明測定血清和海馬組織中Aβ含量。

1.8 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對AD大鼠認(rèn)知功能的影響

AD組逃避潛伏期明顯長于正常對照組（P＜0.05），跨越平臺的次數(shù)明顯少于正常對照組（P＜0.05）；紅景天干預(yù)組逃避潛伏期明顯短于AD組（P＜0.05），跨越平臺的次數(shù)明顯多于AD組（P＜0.05），紅景天苷能夠改善大鼠認(rèn)知能力，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越次數(shù)（±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越次數(shù)（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與 AD 組比較，#P＜0.05

跨越次數(shù)（次）5.46±0.311.76±0.14*3.17±0.37#組別正常對照組AD組紅景天干預(yù)組逃避潛伏期（s）14.25±1.5640.96±3.26*25.04±32.58#

2.2 紅景天苷對AD大鼠海馬組織內(nèi)ROS生成和SOD活性影響

大鼠海馬組織內(nèi)ROS和SOD含量見表2。AD組大鼠海馬組織內(nèi)SOD含量明顯低于正常對照組（P＜0.05），ROS含量明顯高于正常對照組（P＜0.05）；紅景天干預(yù)組大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)SOD含量明顯高于AD組（P＜0.05），ROS含量明顯低于AD組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬SOD和ROS表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠海馬SOD和ROS表達(dá)比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與 AD 組比較，#P＜0.05

ROS 210.14±9.67320.41±11.93*230.83±11.23#組別正常對照組AD組紅景天干預(yù)組SOD（U/mg）145.27±5.33103.18±4.28*121.33±2.18#

2.3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量比較

與正常對照組比較，AD組大鼠血清和海馬組織中Aβ含量顯著升高（P＜0.05），紅景天干預(yù)組與AD組比較，血清和海馬組織中Aβ 含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量（±s，μg/L）

表3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量（±s，μg/L）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與AD組比較，#P＜0.05

海馬Aβ 0.217±0.0240.672±0.057*0.324±0.064#組別正常對照組AD組紅景天干預(yù)組血清Aβ 2.632±0.5245.864±0.736*4.347±0.582#

3 討論

3.1 紅景天苷對T2DM所致AD大鼠模型認(rèn)知功能障礙改善作用的實驗原理

AD認(rèn)知功能受損早期主要表現(xiàn)是記憶減退和學(xué)習(xí)能力的降低，紅景天苷對T2DM所致AD大鼠模型認(rèn)知功能障礙的改善作用采用Morris水迷宮實驗來評估[9-11]，用本研究方法來評估T2DM所致AD大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶力是一種經(jīng)典的工具。用逃避潛伏期來表示大鼠放入水中到找到隱匿平臺并爬上平臺所需時間。逃避潛伏期愈短，學(xué)習(xí)能力愈強(qiáng)，反映大鼠對空間認(rèn)知能力的越高，具有認(rèn)知功能障礙的大鼠則表現(xiàn)出逃避潛伏期越長。此實驗中，由于前期的強(qiáng)化訓(xùn)練，大鼠對逃生平臺的具體位置有準(zhǔn)確的記憶，撤去平臺后，大鼠將反復(fù)通過原隱匿平臺所在區(qū)域并試圖找到平臺，這種行為反映了大鼠對平臺位置的準(zhǔn)確記憶能力和對前期經(jīng)驗的記憶能力，此稱為記憶保持能力。

在此實驗的測評中，給予高糖高脂高蛋白喂養(yǎng)的AD組大鼠游泳軌跡繁亂、盲目，逃避潛伏期較正常對照組明顯延長。撤去水下隱匿平臺后，AD組大鼠在原隱匿平臺所在象限停留時間較正常對照組明顯延長，跨平臺次數(shù)明顯減少，表明大鼠空間定向、定位能力及記憶能力出現(xiàn)了顯著損傷，也表明T2DM模型組大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙。在水迷宮實驗測評中，紅景天苷干預(yù)治療的AD模型大鼠在學(xué)習(xí)記憶能力方面，表現(xiàn)強(qiáng)于AD組大鼠。在各時間點紅景天干預(yù)組逃避潛伏期較AD組明顯縮短，在測試時間內(nèi)跨平臺次數(shù)明顯增加。提示紅景天苷干預(yù)治療可較好地改善T2DM所致AD組的學(xué)習(xí)記憶功能。以上數(shù)據(jù)表明，紅景天苷對AD實驗大鼠模型的認(rèn)知功能障礙具有很好的改善作用。

3.2 紅景天苷對糖尿病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及氧化應(yīng)激的影響分析

超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[12-13]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，體內(nèi)產(chǎn)生過多活性氧自由基（ROS），氧化程度超出氧化物的清除，從而導(dǎo)致組織損傷[14]。大量生成的ROS不僅直接攻擊細(xì)胞生物膜、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，而且ROS還可以作為第二信使，激活核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增加半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員的酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。ROS水平可直接反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。在生理情況下，體內(nèi)氧自由基生成與清除保持一定的平衡。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是機(jī)體抗氧化平衡的重要指標(biāo)[15]，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，而超氧陰離子自由基具有細(xì)胞毒性，可使脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜，引起炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機(jī)體衰老。因此，生物抗氧化抗凋亡機(jī)制中，SOD的地位愈來愈重要，對人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。

此實驗表明，大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯降低，由此提示紅景天苷在一定程度上能夠增加SOD活性而減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)元細(xì)胞所造成的損傷。

引起學(xué)習(xí)能力和記憶功能衰退又一重要病理因素是海馬組織細(xì)胞凋亡及功能受損。紅景天是一種高效的抗氧化的中藥。紅景天能夠修復(fù)氧化應(yīng)激所造成的細(xì)胞損傷，從而提高大腦學(xué)習(xí)及記憶能力、改善腦細(xì)胞功能，從而改善和治療AD。

3.3 紅景天苷可以降低AD模型大鼠海馬組織中Aβ含量降低

高胰島素血癥時，胰島素與Aβ競爭性結(jié)合胰島素降解酶，使胰島素降解酶活性下降，導(dǎo)致Aβ降解減少，聚集的Aβ可以通過血—腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；反過來，Aβ的沉積又可阻礙胰島素信號的傳遞[12]。胰島素可調(diào)節(jié)Aβ的水平，胰島素抵抗可通過增加Aβ蛋白表達(dá)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。同時，Aβ不能正常降解，逐漸沉積形成老年斑，誘導(dǎo)神經(jīng)退行性變甚至凋亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[15-16]。

細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)和細(xì)胞外β淀粉樣蛋白沉積和大量的神經(jīng)元喪失是AD的主要病理特征。AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是Aβ在腦組織細(xì)胞內(nèi)的異常代謝和沉積。Aβ介導(dǎo)并參與多種神經(jīng)毒副作用，尤其是氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)元凋亡危害最大。本實驗證實，在一定程度上紅景天苷能夠抑制T2DM的胰島素抵抗大鼠的海馬組織內(nèi)ROS生成，提高SOD活性。紅景天苷減少Aβ在腦組織細(xì)胞內(nèi)的異常代謝和沉積，提高神經(jīng)元清除自由基的能力，從而減輕神經(jīng)元的損傷，改善T2DM認(rèn)知功能損傷[17-19]。