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        精血補(bǔ)片HPLC指紋圖譜建立同時(shí)測(cè)定主要成分含量*

        2019-11-01 01:54:44寧良琦鄭艷萍蔡寶昌童黃錦
        藥學(xué)與臨床研究 2019年5期

        寧良琦,鄭艷萍,蔡寶昌,童黃錦

        1 安徽亳州市食品藥品檢驗(yàn)中心,亳州 236803;2 南京海昌中藥集團(tuán)有限公司,南京 210061;3 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,南京 210028;4 江蘇省中醫(yī)藥研究院,南京 210028

        精血補(bǔ)片,別名益腦片,由生曬參、紅參、制何首烏、紫河車、五味子、陳皮等6 味中藥配伍組成的非處方中成藥,具有補(bǔ)肝腎、益血?dú)狻B(yǎng)心神的療效,用于神經(jīng)衰弱、精神萎靡、頭暈?zāi)肯?、心悸失眠等癥[1]。該品在部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第六冊(cè)(WS3-B-1268-92)中只規(guī)定了性狀、顯微鑒別、檢查3 項(xiàng)內(nèi)容,并未涉及有效成分含量測(cè)定等重要檢驗(yàn)項(xiàng)目。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),僅有2 篇報(bào)道精血補(bǔ)片質(zhì)量控制方面的研究[2,3],涉及了薄層色譜法(TLC)對(duì)復(fù)方制劑中各味中藥進(jìn)行定性鑒別和二苯乙烯苷含量測(cè)定的方法,不能全面反映精血補(bǔ)片復(fù)方制劑多成分共同作用的特征。故制定有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是中藥安全有效的必由之路,可以反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量。

        本文采用HPLC 法對(duì)精血補(bǔ)片進(jìn)行系統(tǒng)研究,建立其指紋圖譜及橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素等4 種成分含量測(cè)定方法,為其全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

        1 儀器與藥品、試劑

        LC-20AD 高效液相色譜儀;BP121S 電子分析天平(Sartorius)。

        橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)161231),二苯乙烯苷對(duì)照品(批號(hào)160315),五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)161016),大黃素對(duì)照品(批號(hào)130526)均購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司;精血補(bǔ)片(批號(hào)150902、150601、150901、160401、160301、150903、151101、130301、120303、120301,江蘇海昇藥業(yè)有限公司);乙腈為色譜純;甲醇等試劑為分析純;水為純化水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A),梯度洗脫(程序?yàn)?~10 min,5%~10%B;10~50 min,10%~25%B;50~65min,25%~45%B;65~80min,45%~45%B;80~115 min,45%~80%B);流速:1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

        2.2 對(duì)照品溶液的制備

        精密稱取橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素對(duì)照品適量,分別置于10 mL 量瓶中,甲醇溶解、定容,制得濃度分別為7.879、2.930、0.624、0.194mg·mL-1對(duì)照品溶液(Ⅰ);分別精密量取以上對(duì)照品溶液各1 mL,加至5 mL 量瓶中,混勻后用甲醇定容,配制成含橙皮苷1.576mg·mL-1、二苯乙烯苷0.586mg·mL-1、五味子醇甲0.125 mg·mL-1、大黃素0.039 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液(Ⅱ),過微孔濾膜,即得。

        2.3 供試品溶液的制備

        精血補(bǔ)片粉碎過65 目篩,稱取粉末樣品0.25 g,置50 mL 具塞錐形瓶中,加入石油醚(60 ℃~90 ℃)20 mL,超聲30 min,過濾,棄去濾液,將固體物蒸干,置于具塞錐形瓶中,量取甲醇20 mL,超聲30 min,過濾,濾液置水浴鍋上70 ℃蒸干,固體物加甲醇溶解,洗滌定容于2 mL 的量瓶中,搖勻,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,過微孔濾膜,即得。

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 精血補(bǔ)片指紋圖譜及含量測(cè)定方法建立對(duì)10 批樣品按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,其混合對(duì)照品HPLC 色譜圖見圖1-A,樣品HPLC 圖譜見圖1-B。根據(jù)10 批不同批次樣品的液相指紋圖譜分析及數(shù)據(jù)計(jì)算,結(jié)果對(duì)比得出共有峰15 個(gè),10 批次指紋圖譜比較見圖1-C。

        圖1 HPLC 色譜圖譜

        2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液(Ⅱ)50、100、200、500、1 000 μL 置1 mL 量瓶中,用甲醇定容,制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品,將稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品,按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè),以進(jìn)樣量X 為橫坐標(biāo),以峰面積Y 為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程及對(duì)照品溶液線性范圍等,見表1。

        表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.4.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)160301)按“2.3”項(xiàng)配制供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,每次進(jìn)樣量10μL,按“2.1”色譜條件檢測(cè),測(cè)定其HPLC 色譜圖,以橙皮苷為參考峰,對(duì)色譜圖中15 個(gè)共有指紋峰進(jìn)行考察,結(jié)果表明,共有指紋峰的保留時(shí)間RSD 均<0.4%,共有峰峰面積RSD 均<1.8%,說明儀器精密度較好。

        2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)160301)按“2.3”項(xiàng)配制供試品溶液,分別于0、4、8、16、24 h 重復(fù)進(jìn)樣,每次進(jìn)樣量10 μL,按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè),測(cè)定其HPLC 色譜圖,以橙皮苷為參考峰,對(duì)色譜圖中的15 個(gè)共有指紋峰進(jìn)行考察,結(jié)果表明,共有指紋峰的保留時(shí)間RSD 均<0.8%,共有峰峰面積RSD均<1.7%,說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

        2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)160301),按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液共6 份,按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè),測(cè)定其HPLC 色譜圖,以橙皮苷為參考峰,對(duì)色譜圖中的15 個(gè)共有指紋峰進(jìn)行考察,結(jié)果表明,共有指紋峰的保留時(shí)間RSD 均<0.7%,共有峰峰面積RSD 均<2.5%,說明方法重復(fù)性良好。

        2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)160301)粉末,精密稱取0.125 g 9 份,置于50 mL 具塞錐形瓶中,按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液,在最后固體物中依次加入混合對(duì)照品溶液0.57、0.57、0.57、0.71、0.71、0.71、0.86、0.86、0.86 mL 后,再用甲醇定容至2 mL,按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè),測(cè)定其HPLC 色譜圖,分別記錄4 種成分的峰面積,根據(jù)“2.4.2”的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黃素的含量和加樣回收率,其平均回收率分別為100.01%(RSD 1.27%)、100.49%(RSD 1.53%)、100.32%(RSD 1.41%)、99.67%(RSD 1.42%)。

        2.4.7 含量測(cè)定 取10 批樣品,按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)4 種成分的含量,結(jié)果見表2。

        表2 樣品4 種成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1,n=3)

        2.4.8 精血補(bǔ)片指紋圖譜相似度分析 取10 批樣品制成供試品溶液,分別精密量取10 μL,依次注入高效液相色譜儀中,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖。將10 批樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版”軟件,以中位數(shù)法對(duì)樣品的指紋圖譜進(jìn)行峰點(diǎn)校正,數(shù)據(jù)匹配分析,生成共有模式圖,10 批樣品溶液匹配色譜見圖1-C,相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。

        表3 10 批精血補(bǔ)片供試品溶液相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

        3 討論

        樣品處理:比較了水浴加熱回流和超聲兩種方式,結(jié)果顯示超聲分離效果較好;80%甲醇和100%甲醇超聲處理,區(qū)別不大;而采用石油醚進(jìn)行脫脂,可去除一些小極性的化學(xué)成分。

        對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描:分別以234 nm、284 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),色譜圖或基線漂移較明顯或色譜峰數(shù)較少;以254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),色譜峰數(shù)目較多且分離度較好,基線平穩(wěn),峰形對(duì)稱。

        對(duì)流動(dòng)相選擇時(shí)發(fā)現(xiàn):甲醇-水洗脫出的峰分離度不好,且峰形欠佳;乙腈-水洗脫出的峰數(shù)目較多、分離度較高,個(gè)別峰形不佳,可在水相中加入少量甲酸改變峰形,故選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相。

        中藥指紋圖譜技術(shù)采用宏觀分析方法,能基本反映中藥的化學(xué)成分及其含量分布狀況,可以用來作為鑒別中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)在建立精血補(bǔ)片的HPLC 指紋圖譜的基礎(chǔ)上,實(shí)現(xiàn)了通過相似度分析對(duì)不同批次精血補(bǔ)片質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),可解決本品以單一化學(xué)成分作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的局限性問題,也為精血補(bǔ)片的質(zhì)量控制提供了新的參考。

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