陸凡 武紅麗 沙鳳 曹祁 陳姣 曹飛 韋萍

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816)

自抗生素被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域后，許多感染性疾病得到了有效控制，新生兒死亡率及手術(shù)后感染率大大降低，因此延長了人類生存的平均壽命。然而，細(xì)菌的耐藥性也隨之產(chǎn)生，人類的健康和生命安全又面臨新的考驗[1]。當(dāng)前，面對日趨嚴(yán)峻的“抗菌”形勢，一些國家已經(jīng)開始采取激勵措施，鼓勵新抗生素的研發(fā)。美國于2012年7月通過了《鼓勵開發(fā)抗生素法案》(GAIN)，根據(jù)規(guī)定，符合標(biāo)準(zhǔn)的抗生素藥物將獲得額外5年的市場獨占權(quán)，以幫助開發(fā)者收回投資。然而新抗生素的開發(fā)難度越來越大，因此通過復(fù)方抗生素來提升治療效果也是解決細(xì)菌耐藥性的途徑之一[2]。

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦(2)本身幾乎不具有抗菌活性[3]，但其抑酶譜廣，與其他抗生素聯(lián)用可有效恢復(fù)或增強(qiáng)其活性。2015年2月，由阿特維斯與阿斯利康聯(lián)合研發(fā)的阿維巴坦與頭孢他啶組成的復(fù)方藥物avycaz獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，用于治療成人復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染及復(fù)雜性尿路感染等系列疾病[4-5]。阿維巴坦屬于DBOs類化合物，化學(xué)名為[(1R,2S,5R)-2-(氨基羰基)-7-氧代-1,6-二氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛-6-基]硫酸單酯。其合成路線非常繁多，起始原料大致可分為L-焦谷氨酸衍生物、手性的哌啶環(huán)衍生物等，而以L-焦谷氨酸衍生物為起始原料的合成路線大都需要經(jīng)歷開環(huán)后增碳再閉環(huán)形成哌啶環(huán)衍生物的步驟[6]。因此，人們開始研究直接以手性的哌啶環(huán)衍生物為原料的合成路線。2014年，默克公司的一個研發(fā)小組報道了以手性哌啶環(huán)衍生物順式-5-羥基哌啶-2-甲酸(cis-5-hydroxy-L-pipecolic acids,cis-5-hypip,1)為原料，合成同樣具有二氮雜二環(huán)辛烷基本骨架的化合物，總收率高達(dá)39%，且該工藝路線具有公斤級放大規(guī)模的潛力[7]。而從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，阿維巴坦具有兩個手性中心，這兩個手性中心都在哌啶環(huán)上，因此以cis-5-hypip作起始原料，則可較好地解決手性光學(xué)純度問題(圖1)。cis-5-hypip同樣也是TNF-α轉(zhuǎn)化酶抑制劑[8]合成的重要中間體。其本身也對導(dǎo)致存儲谷物腐敗的曲霉菌具有抑制作用[9]。目前，對cis-5-hypip合成的研究，主要分為化學(xué)合成和酶促合成兩個方面。

圖1 cis-5-hypip(1)與阿維巴坦(2)Fig.1 cis-5-hypip(1)and avibactam(2)

1 化學(xué)合成cis-5-hypip

Bailey等[10-11]以谷氨酰胺(3)為原料，將其轉(zhuǎn)化為N-芐氧基羰基甲酯(4)后，用亞硝酸叔丁酯作為[NO]+的來源并在乙腈中進(jìn)行處理，使其側(cè)鏈酰胺基團(tuán)選擇性水解的同時沒有水解酯或氨基甲酸酯，從而得到光學(xué)純的N-芐氧基羰基-L-谷氨酸-α-甲基酯(5)(Z-Glu-OMe，Z=芐氧基羰基)(74%)。用氯甲酸乙酯處理(5)后與混合酸酐和重氮甲烷反應(yīng)生成重氮甲酮(6)(收率82%)，接著通過碳烯引入N-H鍵將(6)轉(zhuǎn)化為受保護(hù)的5-氧代哌啶酸(7)(75%)。最后用硼氫化鈉立體特異性還原得到cis-5-hypip衍生物(8)(93%)，脫保護(hù)，得到最終產(chǎn)物(1)(圖2)，總收率為42%。但是該方法有使用工業(yè)上難以使用的重氮甲烷的工序，因此難以工業(yè)化，還存在所得到的化合物為立體異構(gòu)體的混合物的問題。

Krishnamurthy等[12]以具有叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)的丙二酸二乙酯(9)為原料，在乙醇鈉中用過量的4-溴-1-丁烯處理(9)，得到烷基化二酯，接著用固體LiOH選擇性皂化，得到半酸半酯，在回流甲苯中脫羧，得到(RS)-10(相對于9的總收率為59%)。用α-胰凝乳蛋白酶處理后得到純的對映體2-氨基-5-己烯酸衍生物(R)-10(51%)、(S)-11(46%)。在Et3N中用乙基溴將(S)-11酯化，得到(S)-10，產(chǎn)率84%。接著用過量的m-CPBA進(jìn)行一系列處理得到環(huán)氧化物(12)(產(chǎn)率為90%)。再將非對映異構(gòu)環(huán)氧化物(12)分離得到手性二醇(2S,5S)-13和手性環(huán)氧化物(2S,5R)-12，收率分別為46%和47%。其中手性環(huán)氧化物(2S,5R)-12經(jīng)過6步反應(yīng)最終可以得到反式-5-羥基哌啶-2-甲酸。而手性二醇(2S,5S)-13在催化劑的作用下用TsCl處理二醇的選擇性甲苯磺酰化得到單甲苯磺?；a(chǎn)物(14)。使用NaI將(14)中的甲苯磺酰基基團(tuán)用碘基團(tuán)取代，得到(2S,5S)-15(95%)。接著除去Boc基團(tuán)使分子內(nèi)環(huán)化后用Boc基團(tuán)再次重新保護(hù)氨基酸的氮，得到(2S,5S)-16(76%)，最后將其轉(zhuǎn)化為(1)(圖3)。該方法需要兩次分離非對映異構(gòu)體，每次分離都只能有一半的收率，導(dǎo)致最終總收率更低(7%)，且分離步驟較復(fù)雜，很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖2 cis-5-hypip的化學(xué)合成路線一[11]Fig.2 Chemical synthetic route of cis-5-hypip[11]

2016年，竹原潤等[13]以(3S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(17)為原料，先將羥基進(jìn)行保護(hù)得到(18)，接著將(18)中的酯基還原從而合成(3S)-4-氯-3-(四氫吡喃-2-基氧基)-丁烷-1-醇(P=四氫吡喃基)(19)，對它的羥基進(jìn)行磺酸酯化從而得到(3S)-甲磺酸-4-氯-3-(四氫吡喃-2-基氧基)-丁酯(20)，將其與乙酰基氨基丙二酸二乙酯(21)反應(yīng)后得到(22)，環(huán)化，脫保護(hù)，得到(5S)-1-乙?；?5-羥基-哌啶-2,2-二甲酸二乙酯(24)。接下來將(24)中的酯基水解，通過使一個羧基與羥基反應(yīng)而進(jìn)行內(nèi)酯化，然后使羧基脫羧得到(26)；或者將酯基水解，通過將一個羧基脫羧而得到2位單羧酸的立體異構(gòu)體混合物(25)，接著使該立體異構(gòu)體混合物進(jìn)行異構(gòu)化內(nèi)酯化得到(26)。最后將(26)中的內(nèi)酯水解，并使其中的酰胺鍵斷裂，從而得到順式-5-羥基哌啶-2-甲酸，總產(chǎn)率達(dá)到44.8%(圖4)。該方法避免了因立體異構(gòu)體拆分導(dǎo)致產(chǎn)物較大損失的問題，具備工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

2 酶促合成cis-5-hypip

由于化學(xué)合成需要分子內(nèi)環(huán)化生成哌啶環(huán)且需要復(fù)雜的手性拆分方法，因而導(dǎo)致較長的合成步驟，使得總產(chǎn)率較低。而酶具有高度選擇性和專一性的特征，因此，人們也開始研究通過生物法制備cis-5-hypip。不同于化學(xué)合成中需要進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化形成哌啶環(huán)，生物法可以運用酶的立體和區(qū)域選擇性，直接在L-哌啶甲酸(L-pipecolic acid,L-Pip)的5位碳上進(jìn)行羥基化，這其中的關(guān)鍵酶為哌啶甲酸羥化酶(pipecolic acid hydroxylases,PiHs)。2016年，Hibi等[14]發(fā)現(xiàn)了來自于Fusarium oxysporumc8D和Aspergillus nidulansFGSC中的兩種順式-4-哌啶甲酸羥化酶基因(FoPip4H和AnPip4H)，可以將L-Pip羥基化生成順式-4-羥基哌啶甲酸。2017年，Huttel等[15]從Streptomycessp.和Frankia alni中發(fā)現(xiàn)了兩種PiHs(GetF和PiFa)，但是這兩種酶只能對L-Pip的3位碳進(jìn)行羥基化，5位羥基化的哌啶甲酸羥化酶至今還沒有被發(fā)現(xiàn)。而在之前的報道中，脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases,PHs)具有較為寬廣的底物選擇性，可以催化L-Pip生成羥基哌啶甲酸[16-17]，如順式-4-脯氨酸羥化酶(cis-proline-4-hydroxylases,cis-P4H)可以將L-Pip羥基化生成cis-5-hypip。為了降低成本，人們又以L-賴氨酸(L-lysine,L-Lys)為原料，通過賴氨酸環(huán)化脫氨酶(lysine cyclodeaminase,LCD)生產(chǎn)L-Pip，最終形成了從L-Lys到L-Pip再到cis-5-hypip的合成過程(圖5)。

圖3 cis-5-hypip的化學(xué)合成路線二[12]Fig.3 Chemical synthetic route of cis-5-hypip[12]

圖4 cis-5-hypip的化學(xué)合成路線三[13]Fig.4 Chemical synthetic route of cis-5-hypip[13]

2.1 賴氨酸環(huán)化脫氨酶

L-哌啶甲酸也是合成許多重要藥物的手性中間體，如卡因類局麻藥物S-利多卡因、S-羅哌卡因、S-布比卡因、S-左布比卡因等[18]。目前，以L-Lys脫去α位氨基來實現(xiàn)脫氨環(huán)化反應(yīng)過程有3條，分別是①L-賴氨酸-α-氧化酶與Δ1-哌啶-2-甲酸酯(Δ1-piperideine-2-carboxylate,P2C)還原酶途徑；②L-賴氨酸-2-氨基轉(zhuǎn)移酶與P2C還原酶途徑；③L-賴氨酸環(huán)化脫氨酶途徑[19]。由于前兩種途徑都是先生成一個P2C中間產(chǎn)物后再由P2C還原酶催化生成L-PA，反應(yīng)需要兩種酶參與且需要分兩步完成，因此人們更加傾向于更高效，更簡便的賴氨酸脫氨環(huán)化酶途徑，其在NAD+的幫助下，可以直接將線性底物L(fēng)-賴氨酸催化環(huán)化成為L-哌啶甲酸，相較其他途徑，更為簡便快捷[20]。

圖5 cis-5-hypip的生物合成過程Fig.5 Biosynthesis route of cis-5-hypip

賴氨酸環(huán)化脫氨酶(LCD)的發(fā)現(xiàn)要歸功于對著名的移植抗排異藥物雷帕霉素的研究[21]。Moluar等[22]在研究鏈霉菌中次級代謝產(chǎn)物雷帕霉素的合成過程時，通過同位素標(biāo)記意外地發(fā)現(xiàn)雷帕霉素中的效價基團(tuán)哌啶甲酰胺來源于初級代謝產(chǎn)物賴氨酸，他們通過基因挖掘技術(shù)，初步獲得了LCD的基礎(chǔ)信息。然而早期對于LCD的研究因為技術(shù)手段的匱乏而十分局限，甚至出現(xiàn)了誤解(認(rèn)為LCD也可以催化D-賴氨酸產(chǎn)生D-哌啶甲酸)。2006年，Gatto等[23]對來源于Streptomyces hygroscopicus的賴氨酸環(huán)化脫氨酶的基因rapL的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了全面的表征并成功的將rapL在大腸埃希菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，同時也對ShLCD的輔酶依賴性做了詳細(xì)的考察，在外源性NAD+存在下，初始速率提高8倍，他們將NAD+進(jìn)行催化利用的過程被稱之為“復(fù)雜NAD+依賴型轉(zhuǎn)化”(complex NAD+-dependent transformation)，豐富了改造這類酶的經(jīng)驗和基礎(chǔ)。2018年，Ying等[24]對以來源于Streptomyces pristinaespiralis的賴氨酸環(huán)化脫氨酶SpLCD進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化，通過X射線衍射法解析SpLCD及其與小分子配體復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)。進(jìn)而對SpLCD進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，并結(jié)合定點突變闡述SpLCD與底物的識別與轉(zhuǎn)運機(jī)制、產(chǎn)物的釋放機(jī)制，篩選出了組合突變株Val61-Val94-SpLCD，相比野生型SpLCD，其催化效率提高了1.81倍，并且解除了底物與產(chǎn)物抑制。隨后利用該組合突變株進(jìn)行了全細(xì)胞催化合成L-Pip的研究，在單次底物上載量為50g/L，分批補料3次的條件下，使最終的L-Pip產(chǎn)物濃度達(dá)到了73.4g/L，展現(xiàn)了一定的實際應(yīng)用潛力。

2.2 脯氨酸羥化酶

由于目前尚未發(fā)現(xiàn)對L-Pip上5位碳進(jìn)行羥基化的PiHs，而PHs具有羥基化L-Pip的能力，因此人們轉(zhuǎn)向?qū)Hs的利用與改造[17]。PHs屬于非血紅霉素Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸(α-KG)雙加氧酶家族，這些酶通過與Fe2+、α-KG和O2產(chǎn)生的高反應(yīng)性鐵基(FeIV=O)復(fù)合物將羥基引入底物上沒有反應(yīng)活性的碳，是具有高度的區(qū)域和立體選擇性的C-H催化反應(yīng)[25]，與NAD(P)H依賴性P450單加氧酶相反，它們的共底物α-KG價格便宜，因此不需要再生循環(huán)系統(tǒng)。根據(jù)不同的區(qū)域和立體選擇性，PHs可以分為4種類型：順式-3-、反式-3-、順式-4-和反式-4-脯氨酸羥化酶(cis-P3H、trans-P3H、cis-P4H和trans-P4H)，分別將L-Pip羥基化形成對應(yīng)的羥基哌啶甲酸(圖6)。

1996年，Lawrence等[26]成功從綠灰菌素生產(chǎn)者Streptomyces griseoviridusP8648中發(fā)現(xiàn)了第一個PHs：trans-P4H。Sankyo公司的科學(xué)家使用Heliocerus oryzae和Acrocylindrium oryzae生產(chǎn)順式-4-羥基脯氨酸，最大產(chǎn)量為30mg/L[27]。Mori等[28-29]使用高靈敏度的HPLC分析篩選了超過3000種放線菌菌株的脯氨酸羥化酶活性，找到了8株具有trans-P4H活性的菌株，還鑒定了4種具有cis-P3H活性的菌株，之后，Mori等[29-34]還對這些基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆并構(gòu)建重組表達(dá)載體，以大腸埃希菌為宿主進(jìn)行異源表達(dá)，為之后進(jìn)一步對這類酶的研究打下了基礎(chǔ)。2009年，Hara等[35]報道了從Sinorhizobium meliloti和Mesorhizobium loti的基因組中鑒定出的cis-P4H，并將這些cis-P4H分別命名為SmP4H和M1P4H，但是這些酶在催化L-Pip生成羥基哌啶甲酸的過程中會產(chǎn)生出兩個區(qū)域異構(gòu)體cis-5-hypip和cis-3-hypip，為了選擇性地生產(chǎn)cis-5-hypip，他們對SmP4H進(jìn)行了3輪定向進(jìn)化并成功地創(chuàng)建了cis-P4H三重突變體V97F/V95W/E114G，大大增加了對cis-5-hypip的區(qū)域選擇性(圖7)，同時還提高了酶的催化活性，使cis-5-hypip的產(chǎn)量達(dá)到778mg/L[36]。Haibin等[37]同樣使用蛋白質(zhì)工程對SmP4H進(jìn)行改造，但即使改變了SmP4H的基因，也會生產(chǎn)出約9%的cis-3-hypip。Keisuke等[38]報道了來自于Swgniliparus rugosus的cis-P4H(SrP4H)，其在將L-Pip羥基化生成cis-5-hypip的過程中，只生成2%的cis-3-hypip，但是這種酶的催化活性較低，產(chǎn)量只有50mg/L。Ryoma等[39]從Xwnorhabdus doucetiaeFRM16和Xwnorhabdus romaniistr.PR06-A中鑒定出兩種具有很高5位羥基化選擇性的PHs(XdP4H和XrP4H)，其中XdP4H只生產(chǎn)出0.17%的cis-3-hypip，同樣XrP4H也只生產(chǎn)1.75%的cis-3-hypip，但是這兩種酶同樣存在催化活性低的問題。洪浩等[40]篩選了現(xiàn)有的PHs序列的同源序列，篩選出一個來自于Kordia jejudonensis的序列，具有較強(qiáng)的催化活性，他們對該羥化酶的氨基酸序列進(jìn)行了突變試驗，得到了多株具有更高5位選擇性的突變株，在催化過程中3位的異構(gòu)體只占到2%左右。

3 小結(jié)

圖6 PHs的類型[17]Fig.6 The different kind of PHs[17]

圖7 PHs的定向進(jìn)化[36]Fig.7 Directed evolution of PHs[36]

隨著細(xì)菌耐藥性的問題越來越嚴(yán)重，阿維巴坦作為一個能與其他抗生素聯(lián)用并提升療效的廣譜抑酶制劑，必將會受到廣泛應(yīng)用。而對于其合成路線中的關(guān)鍵中間體cis-5-hypip的研究也將越受關(guān)注。相對于化學(xué)合成復(fù)雜的手性拆分，導(dǎo)致產(chǎn)率較低，生物方法更加直接與高效，但是目前生物催化也存在一些問題，如SpLCD在催化底物轉(zhuǎn)化過程中酶活力不斷下降，并逐漸開始產(chǎn)生副產(chǎn)物P2C，而PHs在催化過程中的催化活性和選擇性也不是很好，這些都是在工業(yè)化生產(chǎn)之前需要解決的問題。無論是酶促合成或化學(xué)合成的方法，都期待更多、更高效、更利于工業(yè)化生產(chǎn)的cis-5-hypip合成路線的問世。