劉顯勝，王振國，高溫杰，于曉雙，任貴兵

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性發(fā)病率和死亡率均排首位的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，僅2018年新發(fā)病例為208.9萬例，死亡62.7萬例[2]。近年來，隨著新一代測序技術(shù)和突變基因檢測技術(shù)在乳腺癌中的應用與發(fā)展[3]，不斷有新的癌基因和抑癌基因被發(fā)現(xiàn)[4, 5]，為乳腺癌精準治療提供了新的方向。然而部分患者因確診時間晚、病理分型差、對治療不敏感等原因，預后仍不甚理想[6]，因此亟待進一步深入研究乳腺癌的發(fā)病機制及特異性標記物。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白(coiled-coil domain-containing protein，CCDC)是一種由兩個或兩個以上的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成的同寡聚體或寡聚體序列蛋白，可通過基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細胞周期、介導細胞凋亡、影響細胞侵襲能力等多種途徑參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CCDC蛋白在肺癌、甲狀腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[8-11]。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白69(coiled-coil domain-containing protein 69，CCDC69)是近年來新發(fā)現(xiàn)的CCDC家族成員，定位于5號染色體長臂5q33.1，由296個氨基酸構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，CCDC69能夠通過維持紡錘體的正常形態(tài)和功能，進而影響細胞分裂的準確性[12]。CCDC69可通過促進細胞周期依賴性激酶抑制蛋白(alternative reading frame，p14ARF)的表達和抑制p53蛋白的降解，增強卵巢癌細胞對化療的敏感性，并誘導細胞凋亡[13]。目前，關(guān)于CCDC69與乳腺癌的相關(guān)性研究尚不深入。本研究利用癌癥基因組圖集(the cancer genome atlas， TCGA) 數(shù)據(jù)庫，探討CCDC69在乳腺癌組織中的表達情況及潛在作用，為尋找乳腺癌的新的分子診斷途徑和靶向治療方案提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料數(shù)據(jù)來源及預處理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov/)下載了1108例女性乳腺癌組織樣本和112例癌旁組織樣本的mRNA表達譜及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。利用R語言分析包edgeR(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對原始mRNA表達數(shù)據(jù)進行基于加權(quán)截尾均值化M值(trimmed mean of M-values，TMM)標準化[14, 15]，并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換用于后續(xù)分析。

1.2 數(shù)據(jù)篩選及分組 篩選出同一患者的癌組織及癌旁組織基因表達信息的病例111例，用于癌組織及癌旁組織的差異表達分析。篩選出具有完整臨床信息(年齡、TNM分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長因子受體2、生存信息)的病例818例，用于臨床相關(guān)分析。根據(jù)CCDC69的表達量進行排序，選取中位值將818例患者分為高表達組和低表達組，用于預后相關(guān)分析。

1.3 基因集富集分析 使用基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)軟件，選擇“h.all.v6.2.symbols.gmt” 為參照基因集，根據(jù)1108例乳腺癌組織CCDC69的表達量建立連續(xù)表型，按默認加權(quán)富集統(tǒng)計(default weighted enrichment statistic)的方法，設置置換次數(shù)為1000次, 計算CCDC69與參照基因集的皮爾森相關(guān)系數(shù)，并按照相關(guān)系數(shù)大小進行基因排序，計算富集系數(shù)，設置標準化P<0.05, 錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates, FDR)<0.25為顯著性富集標準。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用 SPSS 25. 0 進行統(tǒng)計分析。癌組織與癌旁組織的差異分析用配對t檢驗。臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析采用獨立樣本t檢驗。生存分析采用 Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗。單因素和多因素分析采用Cox比例風險回歸模型分析，并計算風險比(HR)及其95%可信區(qū)間(Cl)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCDC69在癌組織與癌旁組織中的差異表達 CCDC69在同一患者的癌組織中的表達水平(9.922±1.126)低于癌旁組織(12.571±1.388)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。提示在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，CCDC69的表達可能受到抑制(圖1)。

圖1 CCDC69在乳腺癌組織和癌旁組織的表達量比較

2.2 CCDC69表達水平與乳腺癌患者臨床病理指標的相關(guān)性 CCDC69的表達水平與患者的年齡(P=0.020)、腫瘤體積(P=0.027)密切相關(guān)，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠端轉(zhuǎn)移情況、雌激素受體(ER)表達情況、孕激素受體(PR)表達情況和人類表皮生長因子受體2(Her-2)表達情況等指標無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

臨床指標例數(shù)CCDC69表達量tP年齡(歲) ≤656109.940±1.1212.3240.020 >652089.730±1.136TNM分期 Ⅰ～Ⅱ6269.867±1.123-0.8940.372 Ⅲ～Ⅳ1929.950±1.147腫瘤體積(cm) ≤221710.029±1.0912.2210.027 >26019.835±1.138淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 無4029.884±0.058-0.0620.950 有4169.889±1.091遠端轉(zhuǎn)移情況 無8039.896±1.1231.7480.081 有159.383±1.301ER 陰性2019.834±1.278-0.6270.531 陽性6179.902±1.076PR 陰性2759.821±1.258-1.1190.264 陽性5439.920±1.057Her-2 陰性6959.908±1.1461.1290.259 陽性1599.796±1.051

2.3 CCDC69表達水平與乳腺癌患者預后的相關(guān)性 CCDC69的表達水平與乳腺癌患者總體生存期相關(guān)(P=0.004)，高表達組患者總體生存期明顯長于低表達組患者，提示CCDC69低表達可能是一種不良預后因素(圖2)。在單因素分析中，CCDC69的表達量、患者年齡、TNM分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移能影響患者預后(P<0.05)。多因素分析提示CCDC69的表達量、患者年齡、TNM分期、遠端轉(zhuǎn)移是影響患者預后的獨立危險因素(P<0.05，表2)。

圖2 CCDC69表達水平與乳腺癌患者預后的相關(guān)性

表2 影響乳腺癌患者預后的單因素和多因素分析

2.4 CCDC69功能富集分析 GSEA提示， 在乳腺癌樣本中，CCDC69富集到MYC信號通路、E2F信號通路、未折疊蛋白反應、糖酵解基因集，且與上述基因集呈負相關(guān)，說明CCDC69可能通過調(diào)節(jié)以上4條通路發(fā)揮抑制乳腺癌作用(表3)。

表3 CCDC69負相關(guān)的乳腺癌樣本富集的基因集

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，需要根據(jù)TNM分期和ER、PR、Her-2的表達情況及其他基因檢測結(jié)果，選擇個體化的治療策略，并為患者復發(fā)風險和生存質(zhì)量評估提供指導。隨著對CCDC蛋白家族研究的深入，越來越多的證據(jù)表明CCDC蛋白在一些惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用，其中CCDC170與雌激素受體1基因融合可增加乳腺癌的侵襲性和復發(fā)率[16]，CCDC8在乳腺癌組織中的表達量低于良性組織，可能起到抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用[17]。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，首次探討了CCDC69與乳腺癌的相關(guān)性。通過111例癌組織與癌旁組織配對樣本基因表達數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CCDC69在乳腺癌組織中的表達量較正常乳腺組織下降?；?18例具有完整臨床資料的患者樣本基因表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CCDC69的表達量與患者年齡和腫瘤體積相關(guān)，且CCDC69高表達的患者總體生存期明顯長于低表達患者，Cox回歸分析進一步證實CCDC69 mRNA低表達是影響總生存期的獨立危險因素，說明CCDC69在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到抑制作用。

此外，本研究通過對1108例乳腺癌樣本中全基因測序數(shù)據(jù)進行基因富集分析，進一步探討了CCDC69抑制乳腺癌的可能機制。研究表明，MYC基因是乳腺癌中重要的原癌基因，與腫瘤細胞遷移和免疫逃逸密切相關(guān)[18]。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族是調(diào)控細胞周期的重要蛋白，可通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄來控制乳腺癌細胞增殖及凋亡[19]。另外，腫瘤細胞生長過程中需消耗大量的營養(yǎng)和氧氣，普遍存在著微環(huán)境缺氧、營養(yǎng)匱乏、pH改變等情況，而未折疊反應和糖酵解途徑有利于腫瘤在此環(huán)境中生存[20-22]。因此，結(jié)合GSEA結(jié)果，CCDC69可能通過抑制MYC信號通路、E2F信號通路、未折疊蛋白反應和糖酵解途徑發(fā)揮抑制乳腺癌作用。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法揭示了CCDC69作為乳腺癌預后標志物的潛在可能性，并對CCDC69在乳腺癌中的作用機制提出假設，為臨床診治乳腺癌提供新的思路。