劉顯勝，王振國(guó)，高溫杰，于曉雙，任貴兵

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性發(fā)病率和死亡率均排首位的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅2018年新發(fā)病例為208.9萬(wàn)例，死亡62.7萬(wàn)例[2]。近年來(lái)，隨著新一代測(cè)序技術(shù)和突變基因檢測(cè)技術(shù)在乳腺癌中的應(yīng)用與發(fā)展[3]，不斷有新的癌基因和抑癌基因被發(fā)現(xiàn)[4, 5]，為乳腺癌精準(zhǔn)治療提供了新的方向。然而部分患者因確診時(shí)間晚、病理分型差、對(duì)治療不敏感等原因，預(yù)后仍不甚理想[6]，因此亟待進(jìn)一步深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及特異性標(biāo)記物。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白(coiled-coil domain-containing protein，CCDC)是一種由兩個(gè)或兩個(gè)以上的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成的同寡聚體或寡聚體序列蛋白，可通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞周期、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞侵襲能力等多種途徑參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CCDC蛋白在肺癌、甲狀腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[8-11]。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白69(coiled-coil domain-containing protein 69，CCDC69)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的CCDC家族成員，定位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂5q33.1，由296個(gè)氨基酸構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，CCDC69能夠通過(guò)維持紡錘體的正常形態(tài)和功能，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂的準(zhǔn)確性[12]。CCDC69可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制蛋白(alternative reading frame，p14ARF)的表達(dá)和抑制p53蛋白的降解，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。目前，關(guān)于CCDC69與乳腺癌的相關(guān)性研究尚不深入。本研究利用癌癥基因組圖集(the cancer genome atlas， TCGA) 數(shù)據(jù)庫(kù)，探討CCDC69在乳腺癌組織中的表達(dá)情況及潛在作用，為尋找乳腺癌的新的分子診斷途徑和靶向治療方案提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料數(shù)據(jù)來(lái)源及預(yù)處理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cancer.gov/)下載了1108例女性乳腺癌組織樣本和112例癌旁組織樣本的mRNA表達(dá)譜及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。利用R語(yǔ)言分析包edgeR(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對(duì)原始mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基于加權(quán)截尾均值化M值(trimmed mean of M-values，TMM)標(biāo)準(zhǔn)化[14, 15]，并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換用于后續(xù)分析。

1.2 數(shù)據(jù)篩選及分組 篩選出同一患者的癌組織及癌旁組織基因表達(dá)信息的病例111例，用于癌組織及癌旁組織的差異表達(dá)分析。篩選出具有完整臨床信息(年齡、TNM分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、雌激素受體、孕激素受體、人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2、生存信息)的病例818例，用于臨床相關(guān)分析。根據(jù)CCDC69的表達(dá)量進(jìn)行排序，選取中位值將818例患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，用于預(yù)后相關(guān)分析。

1.3 基因集富集分析 使用基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)軟件，選擇“h.all.v6.2.symbols.gmt” 為參照基因集，根據(jù)1108例乳腺癌組織CCDC69的表達(dá)量建立連續(xù)表型，按默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)(default weighted enrichment statistic)的方法，設(shè)置置換次數(shù)為1000次, 計(jì)算CCDC69與參照基因集的皮爾森相關(guān)系數(shù)，并按照相關(guān)系數(shù)大小進(jìn)行基因排序，計(jì)算富集系數(shù)，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)化P<0.05, 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates, FDR)<0.25為顯著性富集標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用 SPSS 25. 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。癌組織與癌旁組織的差異分析用配對(duì)t檢驗(yàn)。臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。生存分析采用 Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗(yàn)。單因素和多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(HR)及其95%可信區(qū)間(Cl)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCDC69在癌組織與癌旁組織中的差異表達(dá) CCDC69在同一患者的癌組織中的表達(dá)水平(9.922±1.126)低于癌旁組織(12.571±1.388)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。提示在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，CCDC69的表達(dá)可能受到抑制(圖1)。

圖1 CCDC69在乳腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)量比較

2.2 CCDC69表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性 CCDC69的表達(dá)水平與患者的年齡(P=0.020)、腫瘤體積(P=0.027)密切相關(guān)，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況、雌激素受體(ER)表達(dá)情況、孕激素受體(PR)表達(dá)情況和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)表達(dá)情況等指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

臨床指標(biāo)例數(shù)CCDC69表達(dá)量tP年齡(歲) ≤656109.940±1.1212.3240.020 >652089.730±1.136TNM分期 Ⅰ～Ⅱ6269.867±1.123-0.8940.372 Ⅲ～Ⅳ1929.950±1.147腫瘤體積(cm) ≤221710.029±1.0912.2210.027 >26019.835±1.138淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 無(wú)4029.884±0.058-0.0620.950 有4169.889±1.091遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況 無(wú)8039.896±1.1231.7480.081 有159.383±1.301ER 陰性2019.834±1.278-0.6270.531 陽(yáng)性6179.902±1.076PR 陰性2759.821±1.258-1.1190.264 陽(yáng)性5439.920±1.057Her-2 陰性6959.908±1.1461.1290.259 陽(yáng)性1599.796±1.051

2.3 CCDC69表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性 CCDC69的表達(dá)水平與乳腺癌患者總體生存期相關(guān)(P=0.004)，高表達(dá)組患者總體生存期明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組患者，提示CCDC69低表達(dá)可能是一種不良預(yù)后因素(圖2)。在單因素分析中，CCDC69的表達(dá)量、患者年齡、TNM分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能影響患者預(yù)后(P<0.05)。多因素分析提示CCDC69的表達(dá)量、患者年齡、TNM分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2)。

圖2 CCDC69表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

表2 影響乳腺癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

2.4 CCDC69功能富集分析 GSEA提示， 在乳腺癌樣本中，CCDC69富集到MYC信號(hào)通路、E2F信號(hào)通路、未折疊蛋白反應(yīng)、糖酵解基因集，且與上述基因集呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明CCDC69可能通過(guò)調(diào)節(jié)以上4條通路發(fā)揮抑制乳腺癌作用(表3)。

表3 CCDC69負(fù)相關(guān)的乳腺癌樣本富集的基因集

3 討 論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，需要根據(jù)TNM分期和ER、PR、Her-2的表達(dá)情況及其他基因檢測(cè)結(jié)果，選擇個(gè)體化的治療策略，并為患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和生存質(zhì)量評(píng)估提供指導(dǎo)。隨著對(duì)CCDC蛋白家族研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明CCDC蛋白在一些惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用，其中CCDC170與雌激素受體1基因融合可增加乳腺癌的侵襲性和復(fù)發(fā)率[16]，CCDC8在乳腺癌組織中的表達(dá)量低于良性組織，可能起到抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用[17]。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，首次探討了CCDC69與乳腺癌的相關(guān)性。通過(guò)111例癌組織與癌旁組織配對(duì)樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CCDC69在乳腺癌組織中的表達(dá)量較正常乳腺組織下降?；?18例具有完整臨床資料的患者樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CCDC69的表達(dá)量與患者年齡和腫瘤體積相關(guān)，且CCDC69高表達(dá)的患者總體生存期明顯長(zhǎng)于低表達(dá)患者，Cox回歸分析進(jìn)一步證實(shí)CCDC69 mRNA低表達(dá)是影響總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明CCDC69在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到抑制作用。

此外，本研究通過(guò)對(duì)1108例乳腺癌樣本中全基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因富集分析，進(jìn)一步探討了CCDC69抑制乳腺癌的可能機(jī)制。研究表明，MYC基因是乳腺癌中重要的原癌基因，與腫瘤細(xì)胞遷移和免疫逃逸密切相關(guān)[18]。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)控制乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡[19]。另外，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中需消耗大量的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，普遍存在著微環(huán)境缺氧、營(yíng)養(yǎng)匱乏、pH改變等情況，而未折疊反應(yīng)和糖酵解途徑有利于腫瘤在此環(huán)境中生存[20-22]。因此，結(jié)合GSEA結(jié)果，CCDC69可能通過(guò)抑制MYC信號(hào)通路、E2F信號(hào)通路、未折疊蛋白反應(yīng)和糖酵解途徑發(fā)揮抑制乳腺癌作用。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法揭示了CCDC69作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的潛在可能性，并對(duì)CCDC69在乳腺癌中的作用機(jī)制提出假設(shè)，為臨床診治乳腺癌提供新的思路。