田 潔,孫玉坤,尹 祿,唐 哲,王海鵬
逍遙散出自《太平惠民和劑局方》,后經(jīng)中藥現(xiàn)代化的工藝改造而制成的中成藥制劑逍遙丸[1]。功效為調(diào)經(jīng)養(yǎng)血,疏肝理氣,臨床常用于治療肝氣不舒所致頭昏目眩,食欲不振,月經(jīng)失調(diào),胸脅滿脹等[2-4]。逍遙丸的主要成分包括當歸、白芍、柴胡、薄荷、白術(shù)、茯苓、甘草。市面上與逍遙丸相關(guān)的制劑有逍遙膠囊、濃縮丸、逍遙水丸、逍遙片。2015年版《中國藥典》對以上劑型的質(zhì)量控制僅規(guī)定檢測芍藥苷的含量,而對于其他的化學(xué)成分卻沒有相應(yīng)的檢測標準[5]。文獻[6-8]報道了對逍遙丸中的主要成分阿魏酸、甘草苷、槲皮素、柴胡皂苷的成分檢測。中成藥的復(fù)方制劑中往往含有多種復(fù)雜的化學(xué)成分,單一測定其中一種成分,不能客觀全面地反映藥品質(zhì)量,應(yīng)多種成分同時檢測。本實驗通過對檢測條件的優(yōu)化,建立了HPLC法同時對逍遙丸中阿魏酸和甘草酸兩種有效成分含量的測定方法,為逍遙丸的產(chǎn)品質(zhì)量評價提供有效的試驗數(shù)據(jù)。
Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent1260 Infinity 四元泵系統(tǒng)、Agilent1260紫外檢測器等購自安捷倫科技有限公司;DP-uw實驗室超純凈水器購自北京亞歐德鵬科技有限公司;YZ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器購自上海越眾儀器設(shè)備有限公司;ES-E110A電子分析天平購自天津市德安特傳感技術(shù)有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海右一儀器有限公司。阿魏酸對照品(批號:110773-201508)和甘草酸對照品(批號:1405-86-3),均從中國藥品生物制品檢定所購得;被測樣品均為市售的逍遙丸;甲醇和乙腈、色譜純由sigma試劑公司生產(chǎn);磷酸、分析純購自德州潤昕實驗儀器有限公司。
2.1 色譜條件選擇 采用Agilent Zorbax XDB-C18 的色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);梯度洗脫液選用的是乙腈和0.05%磷酸水溶液30∶70(v/v);流速為1.0 ml/min;檢測波長為 278 nm;柱溫設(shè)為35 ℃;每次注入樣品量為10 μl;流動相梯度程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品阿魏酸2.71 mg、甘草酸5.53 mg,置于100 ml 的容量瓶中,然后加入甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,得阿魏酸和甘草酸濃度分別為0.0271 mg/ml、0.0553 mg/ml的對照品溶液,備用。
2.3 供試品溶液的制備 取大約50粒市售逍遙丸(仲景宛西制藥股份有限公司,國藥準字Z44020869),于研缽中反復(fù)研磨至細粉、收集后精密稱取1.0 g粉末置于具塞磨口三角燒瓶中,加入20 ml甲醇溶液搖勻溶解,稱定并記錄重量后,超聲波預(yù)處理20 min,取出三角燒瓶,待降至室溫,再次稱定重量,加入甲醇溶液補充損失的重量,充分振搖后濾過,濾過液減壓干燥,將殘渣搜集于10 ml的容量瓶中,加甲醇搖勻、溶解,并定容至刻度,經(jīng)過微孔濾膜(0.22 μm)濾過,獲得的續(xù)濾液,即為制備的供試品溶液,備用。
2.4 陰性對照溶液的制備 在逍遙丸的配方組成中除去甘草、當歸兩味中藥成分,將柴胡、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷,按照5∶5∶5∶5∶1比例經(jīng)煎煮、濾過、干燥等工藝處理,制成逍遙丸陰性樣品,取其適量陰性樣品參照“2.3”項處理方法制備陰性對照品溶液。分別取10 μl對照品、供試品和陰性品三種溶液注入高效液相色譜儀中,應(yīng)用本文給出的色譜條件對試品進行測定并繪制各自的色譜圖。對得出的三幅色譜圖進行分析比較,發(fā)現(xiàn)陰性對照品溶液在相應(yīng)的保留時間處沒有出現(xiàn)對照品成分吸收峰,說明陰性對照品溶液無干擾(圖1)。
圖1 逍遙丸HPLC色譜圖
2.5 標準曲線的考察 精密吸取“2.2”項下制備的兩種樣品的對照品溶液各2、4、7、10、15、22 μl,依次注入高效液相色譜儀中,根據(jù)前文給出的色譜條件測定兩對照品峰面積值,以峰面積值為縱坐標(Y),以對照品進樣量為橫坐標(X)進行線性回歸,得阿魏酸回歸方程:Y=1.537×106X-31851,r=0.9995,其進樣量在0.054~0.596 μg與峰面積線性關(guān)系良好;甘草酸回歸方程:Y=29058X+3128,r=0.9993,其進樣量在0.110~1.217 μg與峰面積線性關(guān)系良好。
2.6 儀器精密度試驗 精密量取10 μl“2.3”項下制備的供試品溶液,在上述色譜條件下,分6次連續(xù)注入高效液相色譜儀中,詳細記錄各自峰面積并計算RSD值,得阿魏酸的RSD值為0.63%,甘草酸的RSD值為0.88%,表明本實驗所應(yīng)用的器材具有良好的精密度。
2.7 試品穩(wěn)定性試驗 量取“2.3”項下相同批號逍遙丸制備的供試品溶液,從0 h起每2 h注入樣品1次,共測7次,詳細記錄各自峰面積變化,并根據(jù)峰面積計算RSD值,求得阿魏酸峰面積RSD值為0.53%,甘草酸峰面積RSD值為1.02%,結(jié)果表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。
2.8 重復(fù)性試驗 量取“2.3”項下相同批號逍遙丸制備的供試品溶液6份,精密量取10 μl溶液在上述色譜條件下依次注入高效液相色譜儀中檢測。通過計算得阿魏酸平均質(zhì)量RSD值為1.35%,甘草酸平均質(zhì)量RSD值為1.61%,結(jié)果表明此方法具有良好的重復(fù)性。
2.9 加樣回收率試驗 取同一批號(批號Z44020869)市售逍遙丸制劑,含量明確,置于研缽中研細混勻,平均分成6等份,每份取約1.0 g,精密稱定,置于容量瓶中,將“2.2”項下制備的對照品溶液各取10 ml分別加入6個容量瓶中,依照上述供試品溶液制備方法處理,得加樣回收率試品溶液。分別精密量取10 μl溶液依次注入色譜儀中,根據(jù)測定結(jié)果,計算阿魏酸和甘草酸兩種成分的加樣回收率、平均加樣回收率和RSD值(表2)。
表2 逍遙丸中阿魏酸、甘草酸回收率試驗表
2.10 樣品的測定 適量稱取市售逍遙丸樣品6個批次(仲景宛西制藥股份有限公司),按上述對照品溶液制備方法制備樣品供試液,分別精密量取10 μl進樣測定并記錄峰面積,計算阿魏酸和甘草酸的含量,見表3。
表3 6個批次逍遙丸樣品含量測定結(jié)果
通過查閱文獻資料發(fā)現(xiàn),在供試品溶液制備中,對提取溶劑選擇,提取方法與時間優(yōu)化,以甲醇超聲和甲醇加熱回流的提取方式進行對比,發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取法的效率高于加熱回流法,料液比也更加經(jīng)濟。在甲醇超聲提取時間的考察中,分別選取10、20、30、40 min時間點,結(jié)果以20 min為最佳,更長時間不能明顯提高效率,而且浪費時間。
在梯度洗脫液的選擇上,本研究分別考察了甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水、乙腈/磷酸四種配比組合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)逍遙丸的主要成分洗脫與洗脫液的pH值關(guān)聯(lián)較大,甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水均不能達到較好的洗脫效果,通過進一步優(yōu)化,最終選取乙腈/磷酸(0.05%)作為流動相,可使逍遙丸中阿魏酸和甘草酸兩種檢測成分得到良好的分離效果,呈現(xiàn)較好的色譜圖。近年來,已有文獻報道同時檢測逍遙丸中多種成分的研究,在測定多種成分時,對色譜條件的選擇提出了更高要求,每種成分的分離及檢測條件很難達到均衡統(tǒng)一,需要設(shè)置多種實驗條件,也就增加了檢測的復(fù)雜性。
通過各項條件優(yōu)化等措施,筆者建立了一套同時對逍遙丸中阿魏酸和甘草酸的含量檢測方法,此方法雖然檢測的成分較少,但兩種物質(zhì)的最大吸收值相近,選擇一種檢測波長就可達到較好的響應(yīng)值,因此具有操作簡單、靈敏,結(jié)果準確、重現(xiàn)性良好等優(yōu)點,可為市售逍遙丸的質(zhì)量控制提供相關(guān)依據(jù)。