陳 芬 彭瑞宇 王亞林 張麗萍，3

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北省十堰市 442000； 2 昆明愛維艾夫醫(yī)院； 3 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院附屬武漢兒童醫(yī)院

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，近年發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。宮頸癌傳統(tǒng)的治療方法主要采用手術(shù)治療和放射治療：早期患者主要采取手術(shù)治療，中晚期患者主要采取放射治療。在宮頸癌的治療方法中，新輔助化療(NACT)逐漸成為研究的熱點，其優(yōu)點在于：縮小局部病灶、減輕宮旁浸潤、消除亞臨床病灶及增強其對放療的敏感性等?；熾m然在一定程度上可以提高治療效果，可是由化療產(chǎn)生的耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵原因之一。因此探討與耐藥相關(guān)的蛋白對于選擇敏感的化療藥物，提高化療療效成為治療局部晚期宮頸癌患者的關(guān)鍵因素。P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)、生存素(Survivin)是最近研究較熱的與耐藥相關(guān)的基因蛋白，但是關(guān)于三者在宮頸癌中的聯(lián)合檢測少見報道。本課題采用免疫組織化學(xué)和自動圖像分析系統(tǒng)，檢測宮頸鱗癌新輔助化療前后三者的表達，探討三者能否作為預(yù)測宮頸癌新輔助化療的參考指標，進而為宮頸鱗狀癌患者采取有效化療方案和提高近期臨床療效提供一定的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集我院2016年2月—2017年3月間經(jīng)本院病理科活檢確診為宮頸鱗狀細胞癌患者的標本，其中符合在本院行新輔助化療前均未行任何化療、放療和免疫治療的初治患者，及新輔助化療后行手術(shù)切除的石蠟配對標本共30例。所有患者的病理切片均由資深病理科專家復(fù)閱宮頸癌HE病理切片并再次確診。采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2009)子宮頸癌臨床分期標準[2]：宮頸癌Ⅰb2期10例，Ⅱa期20例。且均符合：為初治患者(未接受過化療、放療和免疫治療)；患者年齡在26～64歲之間，平均年齡為46.24歲；癌灶直徑≥4cm；血WBC≥4×109/L，PLT≥100×109/L；心肺肝腎及凝血功能均無異常；無其他惡性腫瘤病史。所選病例均行開普拓聯(lián)合順鉑靜脈滴注的化療方案[3]，具體用法：CPT-Ⅱ60mg/m2,化療第1、8、15天靜脈滴注；DDP 60mg/m2,僅第1天靜脈滴注，并常規(guī)水化。每個療程間隔時間28d?；?個療程后觀察患者的近期臨床療效?；熆偗煶探Y(jié)束后14d，各項生化指標恢復(fù)接近正常水平時，行廣泛全子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，并留取組織石蠟封存。

1．2 實驗方法和主要試劑 采用免疫組化S-P法及自動圖像分析系統(tǒng)來檢測。將選取的石蠟包埋組織，于冰箱冷凍，然后于切片機上連續(xù)切取3～4μm厚的組織切片，用膠片撈起，烘干冷卻后，經(jīng)脫蠟和水化等處理后，微波抗原修復(fù)，均按試劑盒步驟操作。P-gp、MRP1單克隆抗體及Survivin多克隆抗體及SP試劑盒均購于福建邁新生物科技有限公司。分別用PBS緩沖液代替3種一抗作為陰性對照，并用已知的陽性病理切片作為陽性對照片。運用Image Pro Plus 6.0自動圖像分析系統(tǒng),于×200倍鏡下，提取陽性細胞,測定平均光密度值(OD)。

1.3 染色陽性結(jié)果和判定 (1)免疫組化結(jié)果判定標準：P-gp、MRP1陽性染色顆粒位于胞膜和(或)胞漿中， Survivin陽性染色顆粒定位于細胞漿。陽性結(jié)果為胞膜和(或)胞漿中出現(xiàn)淡黃至棕黃色顆粒為陽性。(2)免疫組化陽性信號的圖像分析：運用Image Pro Plus 6.0自動圖像分析系統(tǒng),于×200倍鏡下，隨機選取5個視野,系統(tǒng)自動隨機測定每個視野3個不同的部位,最后提取陽性細胞,測定平均光密度值(OD) 。(3)臨床療效的判定標準為：主要以直接觀察宮頸癌灶的大小變化，及參照陰道B超所測得子宮頸癌灶大小的變化，來判斷其行新輔助化療后的臨床療效。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(UICC)療效判定標準：完全緩解(CR)：可見的腫瘤病變完全消失，維持4周以上；部分緩解(PR)：腫瘤病灶的最大直徑及其最大的垂直橫徑的乘積縮小>50%以上，其他病灶無增大，無新病灶出現(xiàn)，維持4周以上；穩(wěn)定(SD)或無變化(NC)：腫瘤病灶的兩徑乘積縮小不足50%，或增大不超過25%，無新病灶出現(xiàn)，維持4周以上；進展(PD)：腫瘤病灶的兩徑乘積增大25%以上或出現(xiàn)新病灶。臨床有效=CR+PR；臨床無效=SD+PD。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌新輔助化療前、后P-gp、MRP1、Survivin 的表達 P-gp化療后的表達量顯著高于化療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；MRP1化療后的表達量雖然高于化療前水平，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Survivin化療后的表達量顯著低于化療前水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 宮頸鱗癌新輔助化療前后P-gp、MRP1、Survivin的表達

2.2 P-gp、MRP1、Survivin與宮頸癌患者臨床病理因素的關(guān)系 P-gp和MRP1與宮頸鱗癌的FIGO分期、病理學(xué)分級及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)；Survivin與宮頸癌的FIGO分期、病理學(xué)分級無關(guān)(P>0.05)，但是與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),即宮頸鱗癌患者中有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其Survivin表達量高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。見表2。

表2 P-gp、MRP1、Survivin與宮頸鱗癌患者臨床病理因素的關(guān)系達

注：帶☆者為P<0.05，余P>0.05。

2.3 P-gp、MRP1、Survivin的表達對新輔助化療近期臨床療效的預(yù)測 新輔助化療有效組中P-gp的表達量顯著低于無效組；新輔助化療有效組中MRP1的表達量與無效組中MRP1的表達量無差別；新輔助化療有效組中Survivin的表達量顯著低于無效組。 見表3。

表3 化療后P-gp、MRP1、Survivin的表達與近期臨床療效之間的關(guān)系

注：帶☆者為P<0.05，余P>0.05。

3 討論

宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法是根治性手術(shù)和放化療，Ⅰa期～Ⅱa期患者以手術(shù)治療為主，其優(yōu)點是年輕患者可以選擇性的保留卵巢和陰道的部分功能；Ⅱb期及以上者以放療為主；晚期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者，主要采取化學(xué)療法。新輔助化療技術(shù)取得了較好的療效，使得腫瘤體積減小，分期降低，再行手術(shù)切除，可顯著提高手術(shù)質(zhì)量和術(shù)后療效[4]?；熾m然可以提高治療效果，可是由化療產(chǎn)生的耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵原因之一。對化療不敏感的患者實施 NACT 將導(dǎo)致治療延誤，并帶來不良反應(yīng)，加重患者的經(jīng)濟負擔(dān)[5]。因此探討與耐藥相關(guān)的蛋白對于選擇敏感的化療藥物，提高療效成為治療局部晚期宮頸癌患者的關(guān)鍵。

P-gp是一種能量依賴性的，具有跨膜外排泵作用的糖蛋白，是多藥耐藥基因 MDR-1 的編碼產(chǎn)物，經(jīng) ATP 水解供能將藥物主動轉(zhuǎn)運出胞外，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥[6]。P-gp在宮頸癌組織中的高表達，提示其在宮頸癌癌變耐藥的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用[7]。Konishi等[8]采用免疫組化方法檢測47例行新輔助化療的宮頸癌組織中P-gp的表達，并分析影響宮頸癌預(yù)后的臨床病理學(xué)因素，識別預(yù)測宮頸癌化療反應(yīng)的化療耐藥性指標，結(jié)果顯示宮頸癌組織中P-gp的表達率為32%，盡管P-gp的表達與組織學(xué)類型、宮旁浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但是P-gp的表達水平與宮頸癌患者的化療反應(yīng)密切相關(guān)，表達水平越高化療反應(yīng)越差(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，宮頸癌化療有效組P-gp的陽性表達量低于化療無效組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。由此說明，P-gp在宮頸鱗癌組織中的表達水平與新輔助化療療效密切相關(guān)，其表達水平越高，新輔助化療的效果越差，與Konishi[8]報道一致。本實驗也證實了P-gp的表達與宮頸鱗癌的FIGO分期、病理學(xué)分級及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，從而推測P-gp的表達與宮頸鱗癌惡性程度關(guān)系不大。

MRP是一種跨膜轉(zhuǎn)運糖蛋白，介導(dǎo)腫瘤細胞的多藥耐藥，目前已發(fā)現(xiàn) 9 個成員，其中MRP1與腫瘤的多藥耐藥關(guān)系最為密切[5]。彭君臣等[9]研究顯示宮頸鱗癌新輔助化療前后MRP1陽性表達率均高，分別為86.7%、93.3%，兩者無顯著性差異；新輔助化療前宮頸鱗癌MRP1表達陰性和陽性患者有效率無顯著性差異(P>0.05)；認為MRP1不能作為預(yù)測化療療效的一個指標。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌新輔助化療有效組陽性表達平均光密度值為0.386 9±0.003 5；化療無效組中，MRP1平均光密度值為0.376 5±0.006 2，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明MRP1不能作為判斷宮頸鱗癌新輔助化療是否有效的指標，與彭君臣等[9]報道一致。但也可能與本研究例數(shù)較少有關(guān)，同時實驗也顯示MRP1的表達與宮頸鱗癌的FIGO分期、病理學(xué)分級及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。因此，由MRP1介導(dǎo)的多藥耐藥機制尚需大樣本對照進一步研究。

Survivin在宮頸癌中高表達[10]，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。Survivin蛋白在有絲分裂過程中促進轉(zhuǎn)化細胞的異常增殖，從而使其表現(xiàn)為過度表達，抑制凋亡[11]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分抗腫瘤藥物是通過細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，最后導(dǎo)致腫瘤細胞死亡的。Survivin在組織中的表達具有很明顯的特點，在正常組織無表達或低表達。宮頸癌組織中高水平的 Survivin 表達可致宮頸癌細胞凋亡抑制、細胞周期改變，癌細胞增殖過度，癌組織新生血管增多，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、進展[12]。于春霞等[13]選取50例宮頸癌患者作為研究對象，該研究中新輔助化療后的 Survivin 陽性率(34.00%) 顯著低于化療前(78.00%)。本研究表明化療有效組Survivin的表達量顯著低于化療無效組，且化療后的表達量顯著低于化療前水平，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。從而推測宮頸鱗癌組織中Survivin的高表達使得腫瘤細胞的抗凋亡作用增強，進而導(dǎo)致癌組織對化療藥物耐藥性增強。Survivin與宮頸癌的FIGO分期、病理學(xué)分級無關(guān)(P>0.05)，但是與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。即宮頸鱗癌患者中有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Survivin的表達量高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，因此推測Survivin基因的表達可能在一定程度上反映宮頸鱗癌患者的惡性程度。

本研究為小樣本研究，初步表明P-gp、Survivin對宮頸鱗癌患者新輔助化療是否有效有一定的預(yù)測作用。但是由于本研究的樣本例數(shù)較少，其臨床價值和意義需要大樣本多中心對照研究。

綜上所述，通過聯(lián)合檢測宮頸鱗癌組織中的多種耐藥及相關(guān)基因蛋白，可以在一定程度上預(yù)測宮頸鱗癌新輔助化療的有效性，從而更好地指導(dǎo)臨床化學(xué)用藥。對不同的人群，選擇合適的化療藥物，制定合理的個體化治療方案，對保證良好的治療效果及提高患者的生活質(zhì)量具有非常積極的指導(dǎo)意義。