何 巖，韓廣業(yè)，劉 沛，李澤宇，李建昌，吳春磊

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南衛(wèi)輝 453100)

微小RNA(miRNA)是一類含有18～24個(gè)核苷酸的短小非編碼RNA，可以結(jié)合信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated regions,3′-UTRs)，然后促進(jìn)miRNA-mRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物形成，并降解靶向的mRNA[1]。已有很多研究表明miRNA參與多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移[2]。miRNA與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，主要作為潛在的致癌基因和腫瘤抑制基因發(fā)揮作用，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)顯示，miRNA是新型治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的新興候選者，能夠預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后[3-4]。miR-613在多種腫瘤中表達(dá)異常，并可能與腫瘤的預(yù)后相關(guān)，參與調(diào)劑多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖等生物學(xué)過(guò)程，如乳腺癌、肝癌、前列腺癌等[5-7]。因此，2016年9月至2018年2月期間，我們實(shí)驗(yàn)組用前列腺癌細(xì)胞系PC3和LnCap細(xì)胞為研究對(duì)象，研究miR-613在前列腺癌中的表達(dá)及對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料miR-613和miR-NC(廣州銳博生物科技有限公司)；人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1以及人前列腺癌細(xì)胞系LnCap、DU145和PC3；胎牛血清、Opti-MEM?無(wú)血清培養(yǎng)基、Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑、PCR引物(上海Invitrogen公司)；SYBR Green Real Time PCR Master Mix試劑盒、PrimeScriptTMRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、All-in-oneTMmiRNA qPCR kit(廣州復(fù)能基因公司)；一抗鼠抗E2F5(英國(guó) abcam公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗小鼠IgG(武漢博士德公司)、一抗GAPDH(武漢博士德公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(上海碧云天公司)；RNA酶抑制劑(美國(guó) Sigma公司)；Dual-Luciferase Reporter System (美國(guó)Promega公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó) Millipore公司)。

1.2 前列腺癌組織提取及細(xì)胞培養(yǎng)前列腺癌組織和前列腺正常組織于2017年5月至10月收集于河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科。B超引導(dǎo)下前列腺組織細(xì)針穿刺標(biāo)本，并行病理檢測(cè)，免疫組化確診為前列腺癌組織或正常組織，分別選取15例，提前獲取患者知情同意和倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1用Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基，人前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145和LnCap細(xì)胞，用含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))的RPMI 1640培養(yǎng)基，均在5% CO2(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。

1.3 miRNA、質(zhì)粒及細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照正義鏈序列：5′ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]3′，反義鏈序列：5′UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT]3；miR-613序列：3′CCGUUUCUUCCUUG UAAGGA5′；過(guò)表達(dá)E2F5質(zhì)粒構(gòu)建為pcDNA3-E2F5和pcDNA3-空白。細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度為50%～70%。對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC3和LnCap細(xì)胞行不同處理：陰性對(duì)照組(miR-NC或pcDNA3-空白)和實(shí)驗(yàn)組(miR-613或miR-613+pcDNA3-E2F5或miR-613+pcDNA3-空白)。種板12 h后，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，保證miRNA的終濃度為100 nmol/L，24 h后更換培養(yǎng)液。

1.4 總RNA的提取和qPCR分析轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞用于分析E2F5 mRNA表達(dá)情況。用Trizol Reagent提取總的RNA。使用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，然后使用特異性引物及SYBR Green Real Time PCR Master Mix通過(guò)qPCR將cDNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，以GAPDH和U6作為內(nèi)參，結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法分析。E2F5引物序列：上游引物5′CACCTTCTGGTACACAACT GG3′；下游引物5′GGGCTTAGATGAACTCGAC TC3′；GAPDH引物序列：上游引物5′TCCCATCAC CATCTTCCA3′，下游引物5′CATCACGCCACAG TTTCC3′。

1.5 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞用于蛋白表達(dá)的分析。加入細(xì)胞裂解液(RIPA)，其中含有蛋白酶抑制劑(PMSF)，置于冰上(4 ℃)裂解30 min，12 000 g離心15 min收集上清。然后用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。每樣本加25 μg蛋白質(zhì)到SDS-PAGE凝膠行電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用TBST溶液(含5%牛血清白蛋白)室溫下封閉1 h，分別與一抗鼠抗E2F5(1∶1 500稀釋)、一抗鼠抗GAPDH(1∶400稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。第二天用羊抗鼠的二抗(1∶5 000稀釋)、室溫下孵育1.5 h，使用電化學(xué)發(fā)光(electro chemi luminescence，ECL)曝光顯影。

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞約為2 500個(gè)，轉(zhuǎn)染后連續(xù)4 d分別采用Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。每24 h取出轉(zhuǎn)染后待檢測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；避光，加入100 μL的MTS稀釋液(10 μL MTS試劑和90 μL含10%FBS1640培養(yǎng)基)，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h；然后用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測(cè)吸光度A值；以后3 d在固定時(shí)間檢測(cè)，且條件保持一致。

1.7 集落形成實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，消化細(xì)胞并重新接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 500個(gè)；每2～3 d更換培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)10 d；PBS洗3遍；然后加入1 mL甲醇室溫下固定30 min；倒掉甲醇溶液，用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫固定25 min；流水緩慢洗去染液；干燥后拍照、分析計(jì)數(shù)。

1.8 熒光素酶測(cè)定在轉(zhuǎn)染前一天將PC3細(xì)胞接種在96孔板中，miR-613或陰性對(duì)照與E2F5 3′-UTR野生型(Wt)或突變型(Mt)報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。根據(jù)說(shuō)明書用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega，美國(guó))測(cè)定熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞系中miR-613相對(duì)表達(dá)量qPCR結(jié)果顯示，前列腺癌和正常前列腺組織中miR-613相對(duì)內(nèi)參U6的表達(dá)量分別為(1.239±0.125，n=15)和(2.758±0.265，n=15)，與正常前列腺組織相比較，前列腺癌組織中miR-613呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.18，P<0.05，圖1A)；前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)及前列腺癌細(xì)胞系(LnCap、DU145、PC3)中miR-613相對(duì)內(nèi)參U6的表達(dá)量分別為(1.022±0.187)、(0.337±0.106)、(0.408±0.182)和(0.365±0.121)，與正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)相比較，前列腺癌細(xì)胞系(LnCap、DU145、PC3)中miR-613相對(duì)表達(dá)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1B)。

圖1 前列腺癌細(xì)胞系和前列腺癌組織中miR-613相對(duì)表達(dá)情況

A:前列腺癌組織(n=15)；B:前列腺癌細(xì)胞系(U6作為內(nèi)參)。*P<0.05；**P<0.01。

2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，miR-613能夠明顯抑制E2F5表達(dá)，而pcDNA3-E2F5則能夠明顯上調(diào)其表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A、2D、2G、2I)。

CCK8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2、表3)顯示，miR-613能夠明顯抑制PC3和LnCap細(xì)胞的增殖，而過(guò)表達(dá)E2F5后則能夠逆轉(zhuǎn)miR-613誘導(dǎo)的抑制PC3和LnCap細(xì)胞增殖效應(yīng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2C、2F、2H、2J)。

蛋白名稱Control組miR-613組t值P值miR-613+pcDNA3-空白組miR-613+pcDNA3-E2F5組t值P值PC3細(xì)胞E2F50.983±0.1470.452±0.1214.831P<0.050.221±0.0850.526±0.1073.866P<0.05LnCap細(xì)胞E2F50.962±0.1690.339±0.1155.279P<0.050.314±0.0510.722±0.1056.054P<0.05

表2 PC3轉(zhuǎn)染miRNA和E2F5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞吸光度

組別3 d吸光度(A)F值P值4 d吸光度(A)F值P值Control組1.10±0.1514.730.0051.45±0.1485.4<0.01miR-613組0.55±0.080.73±0.10miR-613+pcDNA3-空白組0.63±0.0616.530.003 60.75±0.09103.3<0.01miR-613+pcDNA3-E2F5組1.06±0.091.35±0.11

表3 LnCap轉(zhuǎn)染miRNA和E2F5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞吸光度

組別3 d吸光度(A)F值P值4 d吸光度(A)F值P值Control組1.03±0.0996.41<0.011.53±0.07210.3<0.01miR-613組0.46±0.060.83±0.07miR-613+pcDNA3-空白組0.71±0.0413.30.006 50.86±0.07111.3<0.01miR-613+pcDNA3-E2F5組1.12±0.081.23±0.07

2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3-空白組、轉(zhuǎn)染miR-613+pcDNA3-空白組和轉(zhuǎn)染miR-613+pcDNA3-E2F5組中PC3細(xì)胞集落形成數(shù)目分別為(0.319±0.081)、(0.124±0.047)、(0.329±0.117)；LnCap細(xì)胞集落形成數(shù)目分別為(0.252±0.056)、(0.106±0.044)、(0.314±0.112),與轉(zhuǎn)染pcDNA3-空白組相比較，轉(zhuǎn)染miR-613+pcDNA3-空白組PC3細(xì)胞集落形成數(shù)目顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.583，P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-613+pcDNA3-空白組LnCap細(xì)胞集落形成數(shù)目顯著減少，PC3和LnCap細(xì)胞增殖明顯被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.513，P<0.05)；而在miR-613+pcDNA3-E2F5共轉(zhuǎn)染后，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-613+pcDNA3-空白組相比較，PC3和LnCap細(xì)胞集落形成數(shù)目有顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.819，P<0.05；t=2.97，P<0.05，圖3)。

圖2 miR-613對(duì)E2F5表達(dá)及前列腺癌PC3和LnCap細(xì)胞增殖的影響

A、B、C、G、H:PC3細(xì)胞E2F5；D、E、F、I、J:LnCap細(xì)胞(GAPDH作為內(nèi)參，*P<0.05，**P<0.01)。

A、B:PC3細(xì)胞集落形成結(jié)果(0.5%結(jié)晶紫,×40)及集落形成率柱狀圖；C、D:LnCap細(xì)胞集落形成結(jié)果(0.5%結(jié)晶紫,×40)及集落形成率柱狀圖；1、2、3、4分別代表pcDNA3-空白、miR-613+pcDNA3-空白、miR-613+pcDNA3-E2F5、pcDNA3-E2F5各組(*P<0.05)。

2.4 PC3細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果在PC3細(xì)胞中，用miR-613或Control序列RNA和E2F5 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性能夠被miR-613明顯抑制；但是MUT報(bào)告基因的熒光素酶活性沒(méi)有明顯變化(圖4)。說(shuō)明miR-613能夠直接靶向E2F5 3′-UTR。

圖4 PC3細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-613和E2F5 3′-UTR結(jié)合情況

A：miR-613和E2F5靶基因示意圖；B：PC3細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性強(qiáng)度,*P<0.05。

3 討 論

前列腺癌目前是影響美國(guó)老年男性生活質(zhì)量的最常見(jiàn)惡性腫瘤，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2017年估計(jì)新發(fā)生前列腺癌患者161 360例，位于男性惡性腫瘤的首位；估計(jì)死亡病例約26 730例，占所有男性癌癥相關(guān)死亡的8%[8]。我國(guó)2015年腫瘤數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，前列腺癌的發(fā)生率和死亡率有逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)老年男性健康[9]。miRNA是一類能影響基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，作為癌基因或者腫瘤抑制因子在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，并且在前列腺癌的診斷、治療和預(yù)后中也有重要的作用[10]。在此次研究中，我們先通過(guò)檢測(cè)我院在2016年10月至2017年10月期間收集到的前列腺癌組織標(biāo)本中miRNAs的表達(dá)差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)miR-613在前列腺癌組織中表達(dá)明顯降低。同時(shí)，我們也檢測(cè)了幾種常見(jiàn)的前列腺癌細(xì)胞系中miR-613的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)miR-613在前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)也降低。miRNA-613與癌癥發(fā)展密切，越來(lái)越多的證據(jù)表明，miR-613在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等在內(nèi)，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程，發(fā)揮抑癌作用[5-6,11-12]，REN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-613能夠通過(guò)靶向Frizzled7抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

E2F5是E2F家族蛋白中的重要成員，能夠與參與細(xì)胞周期調(diào)控的靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控這些靶基因的表達(dá)[13]。已經(jīng)有研究結(jié)果表明，E2F家族蛋白能夠通過(guò)調(diào)節(jié)參與細(xì)胞周期過(guò)程的基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[14]。據(jù)報(bào)道，在包括食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌和結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中E2F5基因表達(dá)明顯上調(diào)，并可能作為一種獨(dú)立的預(yù)后因素[15-17]，表明E2F5可能是一種癌基因，與腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移的特性關(guān)系密切。而且有研究表明，E2F家族蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期中起關(guān)鍵作用，特別是能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G0/G1轉(zhuǎn)換[18-19]。有一項(xiàng)研究結(jié)果提供了令人信服的證據(jù)，證明E2F5和c-myc的同時(shí)拷貝數(shù)增加與前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[20]。盡管E2F5蛋白傳統(tǒng)上被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄抑制因子，但在不同癌癥中觀察到的結(jié)果表明E2F5蛋白的增加只可能具有致癌作用。MAJUMDER等[21]的研究結(jié)果表明，E2F5/p38軸能夠通過(guò)pSMAD3L激活前列腺癌中的細(xì)胞增殖，E2F5具有作為前列腺癌早期檢測(cè)工具的潛力。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-613檢測(cè)E2F5信使和蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)探究對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC3及LnCap細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-613能夠抑制PC3、LnCap細(xì)胞的增殖，且是通過(guò)抑制E2F5的表達(dá)機(jī)制發(fā)揮作用。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-613也能夠通過(guò)與E2F5基因3′-UTR部分堿基序列互補(bǔ)而相互結(jié)合，靶向調(diào)節(jié)E2F5的表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-613后，E2F5基因在信使和蛋白水平表達(dá)均受抑制。此外，E2F5已被確定為幾種miRNA的靶基因，包括miR-34a[17]，miR-132[22]，miR-154[23-24]，和miRNA-1-3p[25]，調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖等過(guò)程。我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)進(jìn)一步研究和驗(yàn)證該過(guò)程中是否有表觀遺傳的參與和調(diào)節(jié)，以期能夠明確其作用機(jī)制，并為前列腺癌的治療提供理論基礎(chǔ)和新思路。