童深廣 ，郝紅江 ，李洪波 ，陳紅兵 ，曾 辛 ，吳志華 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌大學(xué)，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京100011；4.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；5.江西省兒童醫(yī)院感染科，江西 南昌 330006）

豆粕是大豆提取油脂后的副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%～48%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～2%、碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～15%，氨基酸比例均衡，因此豆粕是優(yōu)良的植物性蛋白來源[1-3]。但由于豆粕中所含有的大豆過敏原蛋白、胰蛋白酶抑制劑、Kuniz蛋白酶抑制劑等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，導(dǎo)致其營養(yǎng)利用率較低。目前，對于豆粕蛋白或其他食物蛋白的吸收利用研究，以體外模擬消化為主[4]。已有報道稱[5]，對幾種蛋白含量較高的食物進行胃腸模擬消化后，仍可檢測到穩(wěn)定的過敏原蛋白[6-8]。趙元等[9-11]研究了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在不同齡乳豬胃腸道內(nèi)的吸收和分布。但僅研究某一、兩種蛋白并不能全面地了解豆粕蛋白在體內(nèi)的吸收、分布情況。基于此，有必要探索一種追蹤豆粕蛋白在胃腸道內(nèi)吸收與分布的方法，進一步了解豆粕蛋白在機體胃腸道內(nèi)的吸收、分布。

對于體內(nèi)的示蹤研究，總分為兩類：一類是利用自身性質(zhì)進行示蹤，如利用電感耦合等離子體質(zhì)譜 （Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）直接對顆粒性的金屬及其氧化物在小鼠體內(nèi)的吸收、分布進行研究[12]；另一類為標(biāo)記示蹤，其中標(biāo)記示蹤又分為免疫標(biāo)記和非免疫標(biāo)記兩種。在許多食品或藥物納米載運體的吸收、分布研究中，同位素標(biāo)記通常是追蹤目標(biāo)分子的一個重要手段[13-14]。對于某一種蛋白在體內(nèi)的示蹤，主要利用穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)來研究其代謝分布[15]，但對成分復(fù)雜的食物蛋白均勻地進行標(biāo)記比較困難，而免疫標(biāo)記方法比較適合。

豆粕中含有多種過敏原蛋白，其作為生物大分子所擁有的抗原性，給豆粕蛋白在胃腸道內(nèi)吸收、分布的免疫標(biāo)記研究帶來了新思路。由于豆粕中的過敏原蛋白進入機體消化后仍保持穩(wěn)定，因此基于抗原-抗體反應(yīng)即可對其定位，進而追蹤豆粕在胃腸道內(nèi)的分布。豆粕中的主要過敏原是β-伴大豆球蛋白，占總蛋白的l0%～12.7%[16-17]，其穩(wěn)定性強，耐酶解，不易消化[18]。β-伴大豆球蛋白的致敏原性往往在到達(dá)腸道時才顯現(xiàn)，說明其在腸道中基本結(jié)構(gòu)沒有受到破壞。它的這一特性，使得β-伴大豆球蛋白可作為胃腸道內(nèi)豆粕吸收數(shù)量的定量檢測標(biāo)記物。

本研究對小鼠進行一次性灌胃豆粕，經(jīng)過不同時間段后，處死小鼠并解剖獲得其胃腸道樣品。以過敏原蛋白中β-伴大豆球蛋白作為定量檢測標(biāo)記物，定量檢測經(jīng)過不同時間段后豆粕在胃腸道內(nèi)的吸收數(shù)量。并以豆粕蛋白中的全蛋白作為抗原，采用免疫金銀染色技術(shù)定位，顯微觀察豆粕蛋白在胃腸道內(nèi)的分布，探究豆粕在小鼠胃腸道內(nèi)的吸收數(shù)量、分布位置。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-伴大豆球蛋白試劑盒：泉州科諾迪生物有限公司；膠體金標(biāo)記羊抗兔（二抗）：北京博奧技術(shù)有限公司；兔抗大豆蛋白（一抗）：購于美國Sigma公司；yellow-green505/510熒光微球：美國Thermo公司；載玻片、蓋玻片：購于江蘇世泰實驗器材有限公司；OCT包埋劑：泰州櫻花醫(yī)療科技有限公司；其余試劑：均購于上海阿拉丁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Cryotome E冰凍切片機：美國Thermo公司；RM2016石蠟切片機：德國徠卡儀器有限公司；Zeiss-Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡：德國蔡司股份公司；微波爐：中國格蘭仕電器有限公司；Mode1869酶聯(lián)免疫測定儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗動物及分組

Balb-c雌性小鼠：南昌大學(xué)動物實驗中心。小鼠出生 4～5 周左右，體質(zhì)量（25±5）g，將小鼠放于塑料籠中飼養(yǎng)，然后置于動物房，室溫保持在（25±2）℃，相對濕度（60±10）%，光周期為 12 h 光/暗。 小鼠在灌胃前飼養(yǎng)兩周，使小鼠適應(yīng)環(huán)境，并飼養(yǎng)不含豆粕的飼料。清除豆類食物，減少實驗誤差。小鼠采用隨機組設(shè)計，將鼠分為6組，實驗一組（N=11）、實驗二組（N=11）、實驗三組（N=11）、實驗四組均灌胃豆粕（N=11），陽性對照組灌胃熒光微球（N=11），空白對照組灌胃蒸餾水（N=11）。

1.4 灌胃和樣品采集

實驗組小鼠灌胃100 mg豆粕后，實驗一組、實驗二組、實驗三組、實驗四組分別于 0.5、1、2、4 h 后脫頸椎致死。陽性對照組灌胃1 mg熒光微球，空白對照組灌胃1 mL蒸餾水，此兩組小鼠于灌胃1 h后脫頸椎致死。處死后的小鼠置于解剖盤上，將各胃腸道（胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸）洗凈，去除食糜，截分。用作定量檢測的胃腸道樣品準(zhǔn)確稱其鮮重，并迅速置于液氮中速凍，再置于-80℃冰箱內(nèi)保存。用于蘇木精-伊紅染色和免疫金銀染色的胃腸道樣品，置于盛有4%多聚甲醛的離心管中進行固定。

1.5 胃腸道中豆粕吸收數(shù)量測定

1.5.1 胃腸道處理 胃腸道樣品從-80℃冰箱中取出，常溫解凍，采用組織勻漿法，按照質(zhì)量比1∶10加入pH=8.0 Tris-HCl于冰上進行研磨破碎處理。研碎后取出樣品離心，離心條件為3 000 r/min，離心10 min，取上清液分裝備用。

1.5.2 定量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法進行，測定胃腸道內(nèi)豆粕質(zhì)量比。將胃腸道勻漿上清液利用β-伴大豆球蛋白ELISA試劑盒測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的各胃腸道內(nèi)β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度，提取各部分胃腸道所需的總提取液體積，小鼠體質(zhì)量以及β-伴大豆球蛋白占豆粕中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16，19]，從而定量計算出各胃腸道中豆粕質(zhì)量比。

小鼠各胃腸道部位內(nèi)豆粕質(zhì)量比（C1）由式（1）計算

式中：ρ1為β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度，V1為各胃腸道部位所對應(yīng)的總提取液體積，w為豆粕中β-伴大豆球蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，M為小鼠體質(zhì)量。

熒光微球在小鼠各胃腸道內(nèi)的吸收數(shù)量，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用酶標(biāo)儀測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的各胃腸道中熒光微球質(zhì)量濃度，對應(yīng)的各胃腸道總提取液體積以及小鼠體質(zhì)量從而計算出各胃腸道內(nèi)熒光微球的質(zhì)量比。

小鼠各胃腸道部位內(nèi)熒光微球質(zhì)量比（C2）由式（2）計算

式中：ρ2為熒光微球的質(zhì)量濃度，V2為各不同胃腸道部位所對應(yīng)的總提取液體積，M為小鼠體質(zhì)量。

其中所測得胃腸道內(nèi)的豆粕與熒光微球的數(shù)據(jù)均扣除了空白對照組中所測得的數(shù)據(jù)。

1.6 蘇木精-伊紅染色

小鼠胃腸道內(nèi)的病理組織學(xué)分析采用蘇木精-伊紅染色[20]。首先對固定好的胃腸道樣品制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟后，蘇木精-伊紅染色。具體操作步驟為：從4%多聚甲醛取出胃腸道樣品后，經(jīng)過梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切成石蠟切片。常規(guī)脫蠟，蘇木精染色5 min，鹽酸、酒精分色，蒸餾水沖洗藍(lán)化，梯度乙醇上行，0.5%的伊紅乙醇染色30 s，梯度乙醇脫水，透明中性樹膠封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 免疫金銀染色

豆粕蛋白在小鼠胃腸道內(nèi)的分布采用免疫金銀染色法進行[21-23]。先對固定好的胃腸道樣品制成8～10 μm的冰凍切片，再利用膠體金標(biāo)記羊抗兔二抗對切片進行染色，顯微觀察豆粕在胃腸道內(nèi)的分布。具體操作步驟為：將固定的樣品置于包埋劑中，冷凍后于切片機切成8～10 μm冰凍切片；稍晾干后，置于冷丙酮中固定10 min，于PBS（pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）中晃動洗滌；洗滌后，組織切片浸泡在抗原修復(fù)液中，于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，自然冷卻后，洗滌；再于切片上滴加正常羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；在切片上滴加兔抗大豆蛋白（一抗）于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，孵育后，洗滌；切片甩干后，滴加膠體金標(biāo)記羊抗兔（二抗）覆蓋組織，37℃避光孵育60 min后，洗滌；硝酸銀顯色液避光顯色一定時間后，蒸餾水洗，常規(guī)梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0對數(shù)據(jù)作圖，同時采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA分析，以P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間小鼠胃腸道內(nèi)的豆粕質(zhì)量比

小鼠經(jīng)一次性灌胃豆粕（0.5、1、2、4 h）后，胃腸道內(nèi)的豆粕吸收情況如圖1所示。灌胃豆粕0.5～1 h后，各胃腸道內(nèi)均可檢測到豆粕（P＜0.01），此時直腸內(nèi)的豆粕吸收量最低（0.22±0.04 μg/g），回腸內(nèi)最高（47.3±4.2 μg/g）， 說明此時小鼠胃腸道內(nèi)開始全面吸收豆粕。胃內(nèi)豆粕吸收量在灌胃2 h后明顯減少（P＜0.01），這可能是由于經(jīng)過胃初步消化的豆粕下移至小腸被吸收；灌胃4 h后，胃內(nèi)的豆粕吸收量基本保持不變。小腸前段（十二指腸）內(nèi)，豆粕吸收量在灌胃1 h后顯著減少（P＜0.01），這可能是由于隨著時間的增加，一部分豆粕被十二指腸吸收，另一部分豆粕則經(jīng)過十二指腸下移至小腸中、后段。小腸中、后段（空腸、回腸）內(nèi)，豆粕的吸收量在灌胃2 h后均顯著減少（P＜0.05），原因是小腸中、后段的豆粕逐漸被消化吸收進入小鼠血液循環(huán)[24]，而在灌胃2～4 h，空腸與回腸內(nèi)豆粕吸收量的變化趨勢與胃的相似，基本保持不變，這可能與空腸和回腸內(nèi)未被消化的豆粕有關(guān)[25]。胃腸消化的最后一部分是大腸，大腸前段（結(jié)腸）內(nèi)，在灌胃1 h后豆粕吸收量顯著減少（P<0.01），并在4 h后結(jié)腸內(nèi)的豆粕吸收量顯著增加（P＜0.05），這可能與未被消化的豆粕殘渣有關(guān)[26]。大腸后段（直腸）內(nèi)的豆粕吸收量在不同時間段內(nèi)無顯著變化。以上研究結(jié)果類似于大豆過敏原P34在小鼠體內(nèi)的吸收研究[24]，隨著時間的推移，豆粕吸收量在小鼠胃腸道內(nèi)的不同部位均出現(xiàn)先增高后降低再保持平穩(wěn)的趨勢。

圖1 不同時間段小鼠胃腸道內(nèi)的豆粕質(zhì)量比Fig.1 Time-dependence of gastrointestinal absorption of soybean meal in mice

2.2 胃腸道內(nèi)不同部位的豆粕吸收量占比

將灌胃熒光微球組作為陽性對照組，小鼠經(jīng)一次性灌胃豆粕（0.5、1、2、4 h）后，胃腸道內(nèi)不同部位的豆粕吸收量占灌胃豆粕總量的比例如圖2所示。小鼠在灌胃0.5 h后，胃腸道內(nèi)不同部位的豆粕吸收量占比大小依次為：回腸＞空腸＞十二指腸＞胃＞結(jié)腸＞直腸，胃腸道內(nèi)檢測到的豆粕總量為4.2%；灌胃1 h后，胃腸道內(nèi)不同部位的豆粕吸收量占比大小依次為：回腸＞空腸＞胃＞十二指腸＞結(jié)腸＞直腸，胃腸道內(nèi)檢測到的豆粕總量為4.4%；小鼠在灌胃2 h后，由于攝入的豆粕逐漸被小腸吸收進入血液循環(huán)[23]，因此胃腸道內(nèi)可檢測到的豆粕吸收量明顯減少，其豆粕總量降至2.14%，且此時胃腸道內(nèi)不同部位的豆粕吸收量的變化趨勢與灌胃0.5 h時相同；小鼠灌胃4 h后，胃腸道內(nèi)總豆粕占比與灌胃2 h后的相差無幾，為2.18%，胃腸道內(nèi)不同部位的豆粕占比的變化趨勢與灌胃1 h后的一致。陽性對照組的小鼠在灌胃1 h后，由于熒光微球具有耐消化性，胃腸道內(nèi)可檢測到的熒光微球占比為8%，高于胃腸道內(nèi)檢測到的豆粕總量占比，胃腸道內(nèi)不同部位的熒光微球吸收量占比大小依次為：回腸＞空腸＞胃＞十二指腸＞結(jié)腸＞直腸，其變化趨勢與胃腸道內(nèi)豆粕占比的變化趨勢類似。由此可見，小鼠在灌胃后，豆粕在胃腸道內(nèi)主要分布于小鼠的小腸內(nèi)，也有一小部分豆粕分布于胃中，僅有少量未被吸收的豆粕殘留于大腸內(nèi)，這一分布規(guī)律與趙元等[11]對大豆球蛋白在仔豬胃腸道內(nèi)分布情況的研究結(jié)果類似。

2.3 胃腸道內(nèi)豆粕蛋白的分布

2.3.1 胃腸道的蘇木精-伊紅染色 灌胃豆粕1 h后，對小鼠胃和小腸進行病理組織學(xué)檢查。圖3（a）顯示胃的組織形態(tài)完整，其中大部分細(xì)胞為胃底腺下半部的主細(xì)胞，藍(lán)紫色一側(cè)為黏膜層，粉紅色為肌層，兩者之間為黏膜下層。圖3（b）顯示小腸組織形態(tài)完整，小腸中固有層內(nèi)的結(jié)締組織形態(tài)正常[27]，胞核與胞漿對比鮮明，近基底部被染成藍(lán)紫色，表面一層可見的粉紅色膜狀結(jié)構(gòu)為小腸絨毛，小腸絨毛下面覆有大量的柱狀上皮細(xì)胞，在柱狀上皮細(xì)胞之間夾有呈空泡狀的杯細(xì)胞。由此可以推測，灌胃豆粕對小鼠的胃和小腸的組織形態(tài)不會產(chǎn)生破壞，也沒有炎癥發(fā)生的跡象。

圖2 不同時間段小鼠胃腸道內(nèi)的豆粕占比Fig.2 Ratio of soybean meal in the gastrointestinal tract of mice after uptake

圖3 胃腸道的蘇木精-伊紅染色Fig.3 Hematoxylin-eosin staining of gastrointestinal tract

2.3.2 胃腸道內(nèi)熒光微球和豆粕蛋白的分布 由于熒光微球具有耐消化性，利用其在小鼠胃腸道內(nèi)的分布，作為陽性對照。圖4（a）中，在胃的內(nèi)腔可以觀察到大量的熒光微球，且主要分布于胃黏膜上皮。圖4（b）為熒光微球在小腸內(nèi)的分布情況，從圖中可以看出，有一小部分熒光微球分布于小腸隱窩處，說明這部分熒光微球可能被小腸吸收，大部分熒光微球因不能被消化而聚集在小腸黏膜上皮處[28]。胃腸道中能檢測到的熒光微球數(shù)量高達(dá)8%，而豆粕僅有4.4%左右，由此說明其余豆粕可能被消化降解了。圖4（c,d）為可見光下的光鏡圖作為參照。

圖4 灌胃1 h熒光微球在小鼠胃腸道內(nèi)的分布Fig.4 Location offluorescentmicrospheresin the gastrointestinal tract of mice after 1h uptake

由小鼠胃腸道吸收豆粕量結(jié)果可知，灌胃豆粕1 h后，小鼠胃腸道內(nèi)可檢測到的豆粕質(zhì)量比最高。因此灌胃1 h后，對豆粕中的主要成分豆粕蛋白在小鼠胃腸道不同部位的分布情況進行探究，其分布情況如圖5所示。從灌胃豆粕組的圖5（a-f）中可以看出，陽性信號多位于胃、十二指腸、空腸、回腸的黏膜上皮處，在小腸（十二指腸、空腸、回腸）的上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了很強的陽性信號，同時在空腸、回腸的淋巴小結(jié)中也發(fā)現(xiàn)了陽性信號，而在大腸（結(jié)腸、直腸）中陽性信號較弱，在空白對照組（圖5(g-f)）中未發(fā)現(xiàn)陽性信號。黏膜上皮處的陽性信號表示，胃腸道內(nèi)未被消化的豆粕蛋白可能黏附在胃小凹或小腸絨毛處。而能夠在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)以及淋巴小結(jié)中觀察到陽性信號，一是由于小腸吸收了大量具有抗原活性的豆粕蛋白（圖1、圖2），正如相關(guān)研究表明，β-伴大豆球蛋白在動物胃腸道內(nèi)抗原活性無明顯降低[29]；二是可能與小腸淋巴濾泡中的M細(xì)胞和派爾集合淋巴結(jié)有關(guān)，M細(xì)胞能夠吞噬胃腸道內(nèi)的大分子、顆粒抗原及致病微生物并對其具有轉(zhuǎn)胞吞作用[30]，利用M細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用可以對腸腔內(nèi)的豆粕蛋白進行吸收轉(zhuǎn)運，進而將豆粕蛋白釋放至淋巴組織；與此同時，單核吞噬細(xì)胞（Mononuclear phagocytes，MNP）可以將它們的樹突直接延伸到M細(xì)胞的緊密連接處吸收小腸腔內(nèi)的抗原[31]，直接吞噬豆粕蛋白，進而轉(zhuǎn)運釋放至淋巴組織中。而在大腸（結(jié)腸和直腸）中的陽性信號較弱，可能是由于大腸主要吸收水分和無機鹽，而對蛋白質(zhì)的吸收較少，故分布也較少。

圖5 灌胃1 h豆粕蛋白在小鼠胃腸道內(nèi)的分布Fig.5 Location of the soybean meal protein in the gastrointestinal tract of mice after 1 h uptake

綜上所述，灌胃豆粕1 h后，豆粕蛋白主要分布于小鼠的胃、十二指腸、空腸、回腸黏膜上皮處、小腸的腸上皮細(xì)胞內(nèi)，以及空腸、回腸的淋巴組織中，而在結(jié)腸、直腸中幾乎無豆粕蛋白分布，此分布結(jié)果與吸收定量結(jié)果一致。這說明，小鼠胃腸道對豆粕蛋白的吸收主要發(fā)生在小腸，與其他蛋白質(zhì)的吸收位置相同[9，11]。

3 結(jié) 語

本研究利用豆粕中β-伴大豆球蛋白作為標(biāo)記，對不同時間小鼠胃腸道內(nèi)豆粕的分布進行示蹤。結(jié)果表明，當(dāng)小鼠攝食豆粕0.5～1 h后，豆粕蛋白主要于小腸內(nèi)吸收分布，部分見于胃中，較少量殘余豆粕蛋白分布于大腸內(nèi)。攝食豆粕后2～4 h，豆粕蛋白在小鼠胃腸道內(nèi)的吸收趨于穩(wěn)定，其吸收位置和普通蛋白一致。本研究采用穩(wěn)定的小鼠食物中蛋白質(zhì)作為標(biāo)記進行示蹤，為了解食物在機體胃腸道內(nèi)的吸收和分布情況提供新思路。