李向瑩,趙 烜,秦于思,陳 笛,王存芳*
(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)食品科學與工程學院,山東 濟南 250353)
乳中蛋白質(zhì)主要由酪蛋白和乳清蛋白組成,其中酪蛋白是由磷酸鹽基團和絲氨酸酯化得到的結(jié)合蛋白,約占乳中蛋白質(zhì)80%,乳清蛋白是球狀蛋白,約占乳蛋白的20%[1]。鈣是人體的重要組成成分,參與人體重要的生理活性過程,能夠有效維持體內(nèi)酸堿平衡,具有控制新陳代謝、激素分泌等多種生理活性[2]。乳制品是人類膳食攝取鈣的最佳途徑,能為人體提供合理的鈣磷比。由于乳蛋白自身結(jié)構(gòu)的不同,鈣離子與酪蛋白、乳清蛋白發(fā)生相互作用。該反應(yīng)不僅影響酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,對其自身的熱穩(wěn)定性、乳化性、溶解性、起泡性和凝膠性等功能特性也會產(chǎn)生影響。因此,研究鈣與乳蛋白的相互作用以及對乳蛋白的功能性調(diào)控具有重要意義。
鈣在乳中主要以膠束鈣和可溶性鈣兩種形式存在,這兩種形式的鈣在膠束相和乳清相中形成動態(tài)平衡[3]。在膠束相中,鈣主要是作為無定形膠體磷酸鈣(colloidal calcium phosphate,CCP)存在于酪蛋白膠束中或作為與磷酸絲氨酸殘基結(jié)合的鈣離子的形式存在[4]。其中,CCP中的膠束鈣可參與中和磷酸絲氨酸殘基中的負電荷,起到連接酪蛋白的作用。而乳清相中的可溶性鈣則以檸檬酸鈣、磷酸鹽或游離鈣離子的形式存在[5]。不同乳源中鈣的含量不同,其在膠束相和乳清相中的分布也不盡相同(表1)。
表1 不同乳源中鈣的含量及其分布[6-7]Table 1 Calcium contents and distribution in different milk sources[6-7]
酪蛋白主要由αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白構(gòu)成,其自身的交聯(lián)和聚合的產(chǎn)生均與鈣離子有關(guān)[8]。酪蛋白單體組分含有多個磷酸絲氨酸殘基的磷酸基團,可與鈣離子有效結(jié)合,降低靜電穩(wěn)定機制作用,從而導致酪蛋白酸鹽亞膠束的締合,對穩(wěn)定酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)具有重要作用[9]。由于酪蛋白單體中磷酸鹽含量不同,其對鈣離子的敏感性從高到低依次為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白[10]。此外,在鈣離子存在的情況下形成的酪蛋白絡(luò)合物與單個酪蛋白聚合體相比,酪蛋白絡(luò)合物較聚合體對鈣具有更強的親和性[11]。
圖1 鈣與酪蛋白的相互作用機制Fig. 1 Mechanism of interaction between calcium and casein
αs-酪蛋白可分為αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白。αs1-酪蛋白由199 個氨基酸組成,沒有半胱氨酸殘基,有結(jié)合8 個磷酸根離子的絲氨酸[12]。αs1-酪蛋白與鈣結(jié)合的機制如圖1A所示,αs1-酪蛋白含有3 個疏水性區(qū)域(殘基1~44、90~113和132~199),兩個親水性區(qū)域?qū)⑵溥M行區(qū)分,其中45~89序列的親水性區(qū)域含有磷酸酯基團的結(jié)合位點,經(jīng)酶解后可與鈣離子結(jié)合。與含有的磷酸根離子相似,在中性pH值下,每摩爾磷酸酯基團可結(jié)合8 mol Ca2+[13]。Ca2+與αs1-酪蛋白發(fā)生吸附作用,隨著鈣離子濃度提高,αs1-酪蛋白表面電荷減少,Zeta電位下降,導致CCP鹽含量增加,膠體發(fā)生凝集作用,穩(wěn)定性降低[14]。而通過添加檸檬酸鹽或磷酸鹽可減少乳中的鈣離子含量,CCP減少,乳穩(wěn)定性增加[10]。
如圖1B所示,與αs1-酪蛋白相比,αs2-酪蛋白含有2 個半胱氨酸殘基,形成二硫橋,在絲氨酸上可結(jié)合10 個磷酸根離子,對Ca2+較為敏感[15]。另外,其含有2 個磷酸化絲氨酸殘基簇(SerP-SerP-SerP-Glu-Glu),使其結(jié)合Ca2+的能力增強。αs2-酪蛋白含有2 個疏水性區(qū)域(殘基90~120、160~207)和2 個親水性區(qū)域,含有磷酸酯基團的結(jié)合位點大致位于8~12、56~63、129~133序列中,在中性pH值條件下,每摩爾αs2-酪蛋白可與10 mol Ca2+進行結(jié)合[12]。
如圖1C所示,β-酪蛋白含有一個疏水性的C端區(qū)域和高電荷的N端區(qū)域,是疏水性最強的蛋白質(zhì),在絲氨酸殘基上可結(jié)合5 個磷酸根離子。β-酪蛋白在親水性區(qū)域(殘基1~44)含有磷酸酯基團結(jié)合位點,主要位于14~21序列中,在中性條件下,每摩爾磷酸酯基團可結(jié)合5 mol Ca2+[16]。相對于αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白,β-酪蛋白對Ca2+的敏感性較低。
總之,鈣與酪蛋白相互作用機制在于αs-酪蛋白的磷酸基團以及β-酪蛋白N端的羧基,兩者均具有SerP-SerP-SerPX-SerP序列,共同構(gòu)成酪蛋白的中心位置,對鈣離子較敏感,易于與大量鈣離子結(jié)合,從而產(chǎn)生酪蛋白沉淀[17-18]。
κ-酪蛋白位于酪蛋白膠束外圍,是酪蛋白中唯一一個被糖基化的蛋白質(zhì)。與其他酪蛋白不同,κ-酪蛋白沒有磷酸絲氨酸簇和蘇氨酸糖苷化殘基,只含有1 個磷酸絲氨酸殘基,不能強烈地與鈣離子結(jié)合,對鈣離子誘導沉淀不敏感[19]。在pH 6.6時,每摩爾的κ-酪蛋白只能結(jié)合2 mol Ca2+。κ-酪蛋白這種特殊的化學結(jié)構(gòu),使其具有較強的親水能力,在Ca2+存在時,它可以抑制對鈣離子敏感的αs-酪蛋白和β-酪蛋白發(fā)生沉淀,具有穩(wěn)定酪蛋白膠束空間結(jié)構(gòu)的作用[20-21]。同時,鈣離子也可通過屏蔽帶負電荷的基團來減少膠束電荷,防止κ-酪蛋白在特定pH值下的解離。當κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽鍵被酶分解為副-κ-酪蛋白和酪蛋白糖巨肽時,前者隨酪蛋白膠束一同沉淀,后者由于高負電荷和強極性存在于溶液中,穩(wěn)定作用喪失[22](圖2)。
圖2 凝乳酶對κ-酪蛋白的分解示意圖[22]Fig. 2 Schematic diagram of the decomposition of κ-casein by chimosin[22]
乳清蛋白主要由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白等微量小分子蛋白構(gòu)成[1]。在乳清相中,可溶性鈣質(zhì)量占牛乳中總鈣的31%,主要位于α-乳白蛋白中。與含有較多鈣離子結(jié)合位點的αs-酪蛋白和β-酪蛋白不同,α-乳白蛋白含有1 個鈣活性中心,可以和鈣離子結(jié)合[23]。
α-乳白蛋白是金屬結(jié)合蛋白,與鈣的相互作用機制在于其含有α-螺旋和β-片狀2 個固有結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域由半胱氨酸殘基Cys73和Cys91之間的二硫橋連接,形成Ca2+結(jié)合環(huán)。蛋白分子中的天冬氨酸殘基Asp82、Asp87、Asp88的羧基氧配體和Asp84、Lys79的羰基氧化物以及1 個或2 個水分子均可與1 分子的Ca2+強烈結(jié)合,形成五角雙錐結(jié)構(gòu)[24](圖3)。Ca2+與α-乳白蛋白結(jié)合影響其三級結(jié)構(gòu)以及分子穩(wěn)定性。在pH值低于3.5時,α-乳白蛋白發(fā)生構(gòu)象的酸轉(zhuǎn)變,其原因在于,高濃度的H+對Ca2+結(jié)合部位進行競爭,從而減弱α-乳白蛋白與Ca2+的結(jié)合,引起構(gòu)象的轉(zhuǎn)變[25]。另外,Ca2+與α-乳白蛋白結(jié)合在抵抗熱變性方面具有穩(wěn)定性:在Ca2+存在下,α-乳白蛋白與鈣發(fā)生聚合,其自然態(tài)和變性態(tài)的熱轉(zhuǎn)變溫度超過40 ℃,熱穩(wěn)定性提高,即使在低溫下變性后仍可復性。但當pH值低于5時,α-乳白蛋白由于溫度和濃度的變化發(fā)生構(gòu)象的改變,Asp殘基質(zhì)子化,結(jié)合Ca2+的能力減弱甚至喪失[26],熱穩(wěn)定性降低,低溫下發(fā)生變性,變性后不再復性。由于α-乳白蛋白具有良好的Ca2+親合力,當Ca2+重新與α-乳白蛋白結(jié)合時,在低溫下可恢復其天然結(jié)構(gòu)[12]。
圖3 鈣與α-乳白蛋白的相互作用Fig. 3 Interaction between calcium and α-lactalbumin
乳清蛋白與酪蛋白膠束在經(jīng)過高溫處理時,兩者通過巰基-二硫鍵反應(yīng)發(fā)生相互作用,而鈣離子的存在促進了β-乳球蛋白的熱變性以及其與κ-酪蛋白間的相互作用,使得膠束表面κ-酪蛋白C-末端的“毛發(fā)”部分變得僵直,從而降低膠束的靜電排斥作用和位阻作用,在酪蛋白分子間形成鈣橋,導致乳蛋白產(chǎn)生絮凝[27]。關(guān)于鈣對β-乳球蛋白和κ-酪蛋白相互作用的影響機制,目前研究較少。Smits等[28]發(fā)現(xiàn),Ca2+可能通過與蛋白質(zhì)中的離子基團形成復合Ca2+鍵,導致分子間排斥減少以及分子間疏水鍵的形成,對于較低濃度的β-乳球蛋白和酪蛋白膠束的熱誘導結(jié)合具有促進作用。另外,在乳清相中添加鈣離子可明顯減少酪蛋白膠束中κ-酪蛋白的解離[29]。由此表明,增加乳清中鈣離子含量可促進熱處理后酪蛋白膠束-乳清蛋白聚集體的生成,而降低乳清蛋白聚集體在乳清相中的比例。
鈣離子在乳熱處理時對酪蛋白膠束完整性具有重要作用。85 ℃及以上溫度進行熱處理時,對鈣離子敏感的αs酪蛋白暴露,與游離的鈣離子結(jié)合,從而減少表面電荷量,產(chǎn)生活性位點,膠束平衡發(fā)生破壞,酪蛋白發(fā)生凝聚,產(chǎn)生沉淀[17,30]。Singh等[29]發(fā)現(xiàn),將不同鈣含量乳在90 ℃處理10 min后,可溶性鈣含量低于326 mg/kg時,所有酪蛋白發(fā)生解離,而增加乳中可溶性鈣含量至434 mg/kg時,膠束中αs1酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的解離則會被抑制。此時,鈣離子與游離無機磷酸鹽和檸檬酸鹽的結(jié)合增加,促進磷酸鈣和檸檬酸鈣復合物在膠束中的形成,pH值降低,Zeta電位增加,同時酪蛋白與CCP通過非共價二硫鍵生成酪蛋白聚合體,導致乳中可溶性酪蛋白含量降低,膠束體系不穩(wěn)定,熱穩(wěn)定性降低[31-33]。
當乳清蛋白溶液在65 ℃以上進行高溫處理時,蛋白構(gòu)象展開,活性氨基酸暴露,疏水作用增強。鈣離子的存在不僅提高了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱變性敏感度,還促進了乳清蛋白與鈣離子結(jié)合形成鈣-蛋白復合物,分子間的靜電斥力減小,溶液產(chǎn)生絮凝,乳熱穩(wěn)定性降低[34]。
另外,螯合劑與鈣離子結(jié)合對乳蛋白的熱穩(wěn)定性也會產(chǎn)生重要影響。當添加螯合劑時,乳中鈣鹽的含量和形式發(fā)生重要變化,可溶性鈣濃度顯著上升,而膠體鈣濃度顯著下降。郭本恒[35]認為,在pH 6.6~7.0范圍內(nèi),初乳中加入0.002~0.020 mol/L的螯合劑乙二胺四乙酸,其可與乳中的游離鈣結(jié)合,提高乳蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性(圖4);加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸,其在與游離鈣結(jié)合的同時還會與CCP、酪蛋白爭奪鈣離子,從而破壞膠體平衡體系,降低乳蛋白的熱穩(wěn)定性。
圖4 鈣對乳蛋白的穩(wěn)定性的影響[35]Fig. 4 Effect of calcium on the stability of milk proteins[35]
鈣離子與蛋白質(zhì)結(jié)合,對蛋白質(zhì)在油-水界面的吸附行為以及乳濁液的穩(wěn)定性具有重要影響。如圖5所示,濃縮乳蛋白(milk protein concentrate,MPC)溶液的乳化活性與其脫鈣程度呈正相關(guān),其乳化穩(wěn)定性在脫鈣率為20%~40%時逐步增強,特別是脫鈣率40%的MPC溶液可獲得較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[36]。其原因在于,酪蛋白膠束隨鈣離子的脫除發(fā)生一定程度的解離,蛋白分子在油-水界面的吸附性增強,與油相更好地結(jié)合,同時由于鄰近蛋白間通過疏水相互作用在溶液表面形成薄膜,界面張力降低,表面活性蛋白增加,形成穩(wěn)定的乳濁液,乳化能力增強[37-38]。
王耿等[39]指出,乳化前后添加鈣離子均會導致乳濁液的穩(wěn)定性降低。乳化前添加鈣離子,乳蛋白特別是吸附在油滴表面的蛋白質(zhì)會發(fā)生聚集,表面蛋白有效擴散受到限制,從而導致乳化液滴產(chǎn)生絮凝,其粒徑增大,分子排列更加致密,蛋白間排斥力下降,表面蛋白負載增加,乳濁液的穩(wěn)定性降低[40-41];在乳化后添加鈣離子,親和鈣離子基團暴露,形成蛋白質(zhì)-鈣-蛋白質(zhì)交聯(lián),從而造成蛋白質(zhì)絮凝。
圖5 鈣對乳蛋白的乳化特性影響[36]Fig. 5 Effect of calcium on emulsifying properties of milk proteins[36]
αs1酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白的溶解性與鈣離子濃度有關(guān),而κ-酪蛋白的溶解性不受鈣離子濃度變化的影響。鈣離子濃度能夠明顯影響乳蛋白的溶解性。在鈣離子濃度為1~3 mmol/L時,鈣離子與磷酸絲氨酸基團和羧基化基團結(jié)合,大部分結(jié)合酪蛋白仍保持溶解,濁度稍微增加;在鈣離子濃度達到3~5 mmol/L時,鈣離子繼續(xù)與羧基化基團結(jié)合,減少靜電排斥,酪蛋白溶解性呈現(xiàn)急劇下降,溶液濁度迅速增加最終形成沉淀[11]。有研究學者認為,酪蛋白的聚集導致MPC溶解度的降低,而鈣離子的脫除減少了蛋白之間的非共價交聯(lián),促進MPC的溶解[42]。劉大松等[43]通過測定不同脫鈣程度的MPC在不同貯藏時間的溶解度(圖6)發(fā)現(xiàn),脫鈣率11%~37%的MPC溶液初始溶解度較未脫鈣MPC溶液的初始溶解度高,脫鈣程度與初始溶解度呈正相關(guān);35 ℃培養(yǎng)箱中貯藏112 d,脫鈣率越高的MPC,溶解度隨貯藏時間延長降低得越慢,脫鈣率11%~19%對MPC溶液溶解度的降低具有延緩作用,脫鈣率19%及以上對MPC溶液溶解度降低具有顯著的控制作用,在此條件下,溶解度良好且均達到90%以上。
圖6 鈣對乳蛋白的溶解性影響[43]Fig. 6 Effect of calcium on the solubility of milk proteins[43]
圖7 鈣對乳蛋白的起泡特性影響[47]Fig. 7 Effect of calcium on foaming properties of milk proteins[47]
乳蛋白的起泡特性不僅與其在空氣-水界面的表面張力有關(guān),其亦與鈣離子濃度相關(guān)[44-45]。在乳清蛋白溶液中,Ca2+濃度為0.02~0.40 mol/L時,蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián),形成黏彈性較好的膜,蛋白溶液的起泡性得到顯著改善[46]。乳中鈣離子的脫除對濃縮乳蛋白的起泡性具有促進作用。劉大松[47]通過對不同pH值誘導脫鈣處理的MPC溶液進行起泡性和泡沫穩(wěn)定性(圖7)的測定時發(fā)現(xiàn),pH值從6.7降低到6.0的酸化條件下,脫鈣率從37%增加到55%,MPC溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性略有增加;pH值從6.0降低到5.4的酸化條件下,脫鈣率從55%增加到82%,MPC溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著提高,且脫鈣程度與起泡性和泡沫穩(wěn)定性呈正相關(guān)。鈣離子的脫除使得膠束酪蛋白解離速度加快,游離酪蛋白含量增多,從而加快在泡沫體系中形成穩(wěn)定的界面膜,界面張力降低,泡沫體系黏度增加,溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性增加[48]。
研究表明,牛奶的凝膠化可能由多種因素共同引起,比如CCP含量的增加;通過鈣離子聚集牛奶中加熱的乳清蛋白;鈣離子誘導乳的pH值降低等。因此,鈣與乳蛋白的凝膠特性具有明顯相關(guān)性[49-50]。Ramasubramanian等[51]研究表明,在未預(yù)熱的牛乳中添加10 mmol/L和12.5 mmol/L氯化鈣,加熱不會導致乳凝膠的產(chǎn)生,但會明顯增加牛乳樣品的黏度;而分別在未預(yù)熱的牛乳中添加15、17.5 mmol/L和20 mmol/L氯化鈣時,牛乳樣品的黏度增加,并且伴隨著凝膠的形成。其原因在于,在乳中添加可溶性鈣鹽,乳中鈣離子含量增加,引起CCP含量增加,乳中pH值降低,膠束之間的靜電排斥作用下降,從而誘導加熱乳凝膠的發(fā)生[52]。
鈣的脫除對乳凝膠形成具有抑制作用。徐雨婷[36]將脫鈣MPC凝膠進行激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察,發(fā)現(xiàn)未脫鈣MPC凝膠的組織結(jié)構(gòu)緊密,蛋白分布均勻;11.1%鈣脫除使得凝膠出現(xiàn)空隙,結(jié)構(gòu)變得疏松,影響形成凝膠的強度,但并未阻礙其凝膠結(jié)構(gòu)的形成;18.6%~37.1%鈣脫除使得凝膠結(jié)構(gòu)卷曲程度增加,空隙數(shù)量增多,孔徑增大,凝膠強度降低,阻礙凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成(圖8中A1~A4、I~IV)。當用氯化鈣來回補脫鈣MPC系統(tǒng)時,發(fā)現(xiàn)可溶性鈣的回補可促進蛋白間的交聯(lián),使其形成凝膠結(jié)構(gòu)。11.1%~18.6%脫鈣MPC溶液進行鈣的回補后,可基本恢復未脫鈣時的凝膠結(jié)構(gòu),37.1%脫鈣MPC溶液進行鈣的回補后,則無法恢復原狀(圖8B1~B4、V~VIII)。
圖8 不同脫鈣處理MPC的凝膠特性[36]Fig. 8 Gel characteristics of milk protein with different decalcification treatments[36]
隨著對鈣與乳蛋白相互作用的深入研究,針對其功能特性應(yīng)用于乳品生產(chǎn)中,具有巨大的潛在市場。胡錦華等[27]通過蛋白與難溶性鈣鹽的相互作用制得一種新型鈣增強劑,可將其應(yīng)用于速溶型高鈣乳粉的生產(chǎn)中。Ganugapati[53]通過離子交換脫鈣處理乳蛋白保留物得到一種干燥蛋白成分,可將其應(yīng)用于乳化或蛋白質(zhì)穩(wěn)定的食品生產(chǎn)中。鈣的脫除引起乳的起泡性和泡沫穩(wěn)定性增強,這可擴寬其在攪拌奶油、奶油蛋糕等食品中的應(yīng)用;脫鈣引起乳化能力增強,可擴寬其在巧克力、餅干等食品中的應(yīng)用;脫鈣引起溶解性增強,可擴寬其在半透明或透明飲料中的應(yīng)用;而對于鈣含量增加使乳凝膠性增強這一特點,可將其應(yīng)用于酸奶等發(fā)酵食品中。因此,乳中鈣離子含量的高低是獲得不同需求乳制品的關(guān)鍵。目前,雖有許多研究報道了鈣與乳蛋白的相互作用及其功能特性,但是研究內(nèi)容較片面。不同乳源所含蛋白質(zhì)組成不同,其與鈣離子的作用機理也不盡相同,由此所產(chǎn)生的功能性質(zhì)有待進一步的研究。繼續(xù)開展不同乳源中鈣與蛋白質(zhì)相互作用的研究,根據(jù)其不同的功能特性將其應(yīng)用于功能性乳制品的生產(chǎn)中具有重要實際意義,可為實際生產(chǎn)提供理論支持。