畢靜瑩，李 華*，王 華*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏職業(yè)技術學院生物與制藥技術系，寧夏 銀川 750021）

柑橘屬（Citrus L.）為無患子目蕓香科類植物，是橘、柑、橙、金柑、枳、柚等的總稱。柑橘及其制品中的苦味早已為人們所熟知，其苦味主要由兩類具有抑癌活性的物質提供，一類是以檸檬苦素和諾米林為代表的高度氧化的四環(huán)三萜類次生代謝產物檸檬苦素類似物；另一類是以柚皮苷為代表的黃酮類物質[1-4]。檸檬苦素類似物主要通過清除自由基[5]、激發(fā)谷胱甘肽轉移酶活性[6]、抑制致癌化學物質活性[7-9]、抑制腫瘤細胞增殖[10]等途徑防治腫瘤，能明顯抑制神經瘤[5]、肝癌[11-13]、皮膚癌、乳腺癌、結腸癌[14]、肺癌及胃癌等的發(fā)生，尤其能夠誘導白血病細胞株（HL60）中凋亡蛋白酶依賴的細胞死亡[15]；柚皮苷通過在癌細胞的DNA鏈形成時阻止癌細胞DNA鏈的合成、在癌細胞DNA鏈延長時剪切或縮短DNA鏈，從而抑制腫瘤細胞的增殖；對人淋巴細胞白血病、肝癌[16]、乳腺癌[17]、胰腺癌、胃癌、結腸癌[18]等多種癌細胞增殖具有顯著的抑制作用。

宮頸癌是發(fā)展中國家發(fā)生率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤疾病，占總癌癥發(fā)生率的11%，每年宮頸癌新病例超50萬，而85%發(fā)生在發(fā)展中國家[19]。正常生理活動下細胞增殖與凋亡處于動態(tài)平衡中，而惡性腫瘤是機體細胞過度增殖而引起的疾病，其嚴重程度取決于癌細胞發(fā)生部位、惡化程度及是否轉移，因此研究癌細胞增殖、凋亡和遷移是治療癌癥的關鍵。

鑒于柚類種子和白色海綿層中檸檬苦素類似物[20]和柚皮苷[21]含量較高，故本研究選擇‘高臺’蜜柚這兩部分進行檸檬苦素、諾米林和柚皮苷3 種苦味物質的提取、純化和超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）檢測。通過預實驗并結合文獻[22-23]報道，發(fā)現(xiàn)3 種苦味物質在50 μmol/L時對癌細胞均有顯著的抑制作用，因此本研究均選用50 μmol/L濃度的這3 種苦味物質對宮頸癌HeLa細胞進行處理，利用細胞增殖檢測（cell counting kit-8，CCK-8）、細胞劃痕和逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）實驗研究3 種苦味物質對HeLa細胞增殖、遷移和凋亡的影響，以驗證其作用效應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮完熟的‘高臺’蜜柚，2017年12月中下旬采于四川渠縣，取其種子和白色海綿層（切成1 cm左右的薄片），于50 ℃烘干，恒質量后粉碎機處理，分別過60、40 目篩備用。

HeLa細胞株由西北農林科技大學動物科技學院實驗室培養(yǎng)并保存。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 浙江天杭生物科技股份有限公司；青鏈霉素溶液、杜氏培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）/高糖（high-glucose，HG）培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液 美國Hyclone公司；檸檬苦素、諾米林和柚皮苷（均為色譜純）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；SYBR Green qPCR Master Mix、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒 TaKaRa生物技術（北京）有限公司；RNase-Free ddH2O 生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8試劑盒 諾唯贊生物科技有限公司；TRIzol試劑 天根生化科技有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇（均為分析純） 四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Vortex-Genie 2多功能漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計安捷倫科技有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ICX41倒置熒光顯微鏡 舜宇光學科技（集團）有限公司；MicroCL 21R離心機 美國Thermo Scientific公司；IQ5實時熒光定量PCR儀 美國伯樂公司；LightCycler?480實時熒光定量PCR儀 瑞士羅氏公司；UPLC I-Class UPLC（配有二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 苦味物質的提取、純化

1.3.1.1 檸檬苦素和諾米林的提取和純化

檸檬苦素和諾米林的提取參照孟鵬等[24]的方法，并進行改進。取柚子種子粉末10.0 g，于索氏提取器中用石油醚（沸程60～90 ℃）60 ℃水浴回流脫脂至無色，過濾。按照料液比1∶20加入三氯甲烷，超聲波250 W輔助提取45 min，過濾后10 000 r/min、10 ℃離心10 min，上清液40 ℃旋轉蒸發(fā)至干，加色譜甲醇定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾后按照孟鵬[25]的方法進行檸檬苦素和諾米林的重結晶純化。

1.3.1.2 柚皮苷的提取和純化

柚皮苷的提取參照周石磊等[26]的方法，并進行改進。取白色海綿層粉末10.0 g置于錐形瓶中，以料液比1∶25（m/V）加入體積分數70%的乙醇溶液，250 W超聲波60 ℃輔助提取60 min，提取液過濾后10 000 r/min、10 ℃離心10 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾后按照賈冬英[27]的方法進行柚皮苷的重結晶純化。

1.3.1.3 提取率和純度的計算

提取率和純度分別按式（1）、（2）計算。

1.3.2 苦味物質的UPLC分析

UPLC條件參考NY/T 2011—2011《柑橘類水果及制品中檸堿含量的測定》、NY/T 2014—2011《柑橘類水果及制品中橙皮苷、柚皮苷含量的測定》和孟鵬等[24]的方法進行檢測分析，并進行改進。檸檬苦素和諾米林：流動相為乙腈-水（體積比為45∶55），等度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長215 nm，進樣量1.0 μL；柚皮苷：流動相為甲醇-水（體積比為40∶60），檢測波長283 nm，其他條件同檸檬苦素和諾米林。

1.3.3 HeLa細胞培養(yǎng)及苦味物質對其增殖的影響

1.3.3.1 HeLa細胞培養(yǎng)

細胞復蘇：HeLa細胞株液氮取出后，在37 ℃恒溫水浴鍋中快速解凍，輕輕搖晃凍存管使其在1 min內融化，體積分數為75%的乙醇溶液擦拭凍存管后移至無菌操作臺，凍存管內細胞懸液轉移至2 mL離心管，1 500 r/min室溫下離心2 min，棄培養(yǎng)基，用1 mL含體積分數10% FBS的培養(yǎng)基重懸細胞后轉移至100 mm培養(yǎng)皿中，加入適量體積分數10% FBS、1%雙抗培養(yǎng)基高糖培養(yǎng)基中，上下?lián)u晃使細胞均勻分布后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞傳代：在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞匯合度達到90%時，細胞需要進行傳代。細胞棄原培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細胞2～3 次后加入體積分數0.25%胰蛋白酶溶液，37 ℃消化至顯微鏡下細胞變圓后用槍頭反復吸打培養(yǎng)皿底部至細胞懸浮，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，并將細胞懸浮液轉移至2 mL離心管中，1 500 r/min室溫下離心2 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基洗滌細胞一次后重懸細胞并接種至3 個同尺寸培養(yǎng)皿中。

細胞凍存：細胞培養(yǎng)至對數期時棄培養(yǎng)基，加入體積分數為0.25%胰蛋白酶溶液消化并用離心管收集細胞，并用凍存培養(yǎng)基（V（DMSO）∶V（FBS）∶V（DMEM/HG）＝1∶2∶7）重懸細胞至細胞濃度為1×106～5×106個/mL后移入凍存管中，封口后標注細胞名稱和日期，用凍存盒凍存。

1.3.3.2 CCK-8試劑盒檢測3 種苦味物質對HeLa細胞增殖的影響

HeLa細胞培養(yǎng)至對數期時，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞兩次，用體積分數0.25%胰蛋白酶溶液將HeLa細胞從培養(yǎng)皿上消化下來，用含體積分數為10% FBS、1%雙抗高糖培養(yǎng)基配成細胞密度為5×105個/mL的單細胞懸液，在96 孔板中，每孔加入100 μL單細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后分別加入柚皮苷、檸檬苦素和諾米林，使得3 種物質終濃度為50 μmol/L，每個組設置5 個復孔。處理0 h和24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，每孔加入5 μL CCK-8和95 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長條件下測定OD值。對照組不添加苦味物質，空白組不添加單細胞懸液，細胞抑制率按公式（3）進行計算。

1.3.3.3 RT-PCR檢測3 種苦味物質對HeLa細胞凋亡的影響

根據NCBI數據庫人基因序列，采用Primer 5.0軟件和NEB Tm Calculator軟件設計RT-PCR擴增引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 RT-PCR擴增引物信息Table 1 Primer information of quantitative RT-PCR amplification

3 種苦味物質處理細胞24 h后，回收細胞，利用柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒進行RNA的提取，利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進行cDNA反轉錄。采用表1所設計的引物，使用對經3 種苦味物質處理后的HeLa細胞的Fas、Caspase-9、Caspase-8等基因的相對表達量進行RT-PCR檢測。RT-PCR反應體系如下：SYBR Green qPCR Master Mix 7.5 μL、Primer-F 1 μL、Primer-R 1 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 3.5 μL。RT-PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。

1.3.3.4 細胞劃痕檢測3 種苦味物質對HeLa細胞遷移的影響

取對數期生長的HeLa細胞，棄上清液，加PBS洗滌細胞兩次后使用體積分數0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，用含體積分數為10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基配成細胞密度為5×105個/mL的單細胞懸液，6 孔板每孔加入3 mL單細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待匯合度達到80%時，用槍頭在皿中劃“#”，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3 次后分別加入50 μmol/L柚皮苷、檸檬苦素和諾米林的無血清培養(yǎng)基。并設置空白組（DMSO+無血清培養(yǎng)基），處理0、24 h和48 h后于顯微鏡下拍照，每組設5 個重復。

細胞遷移圖片數據處理采用Image J軟件，相對遷移率按照公式（4）進行計算。

式中：S0、St分別表示0、t/h時的劃痕面積/m2。

1.4 數據處理與分析

基因相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算，差異顯著性分析采用SPSS軟件的獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 苦味物質的檢測

表2為3 種苦味物質的線性范圍及回歸方程。由標準曲線方程可知，檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的線性關系決定系數范圍在0.996 4～0.999 7，說明在質量濃度范圍內線性關系良好。本實驗檸檬苦素類似物的提取率為5.21 mg/g。檸檬苦素和諾米林的純度分別為94.08%和93.91%；柚皮苷的提取率為7.72 mg/g，純度為93.39%。

表2 檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的線性范圍及回歸方程Table 2 Linear ranges and regression equations for calibration curves of limonin, nomilin and naringin

2.2 3 種苦味物質抑癌活性研究

2.2.1 3 種苦味物質對HeLa細胞增殖的影響

50 μmol/L的柚皮苷和諾米林處理HeLa細胞24 h后能明顯抑制HeLa細胞增殖，細胞抑制率分別為（8.05±1.25）%和（4.16±1.35）%；同時，可觀察到處理組培養(yǎng)液中均出現(xiàn)漂浮的死細胞。而檸檬苦素對HeLa細胞抑制率較小，僅為（2.13±0.84）%。

2.2.2 3 種苦味物質對HeLa細胞凋亡的影響

由圖1可知，經過檸檬苦素處理HeLa細胞24 h后，與對照組相比，Bax基因表達量極顯著增加（P＜0.01），Bcl-2基因表達量顯著增加（P＜0.05）；HeLa細胞經過柚皮苷處理24 h后Bax基因表達量較對照組極顯著增加（P＜0.01）；HeLa細胞經過柚皮苷、檸檬苦素和諾米林處理24 h后TNFR1基因表達量較對照組有明顯的增長趨勢，而Casepase-8基因表達量較對照組無明顯變化。此外，經這3 種物質處理HeLa細胞24 h后，Caspase-9、Caspase-3、Fas、Cytochrome c基因表達量與對照組相比均無顯著變化（此部分數據和圖未呈現(xiàn)）。

圖1 3 種苦味物質對HeLa細胞Bax（A）、Bcl-2（B）、TNFR1（C）、Caspase-8（D）基因相對表達量的影響Fig. 1 Effects of three bitter substances on relative expression levels of Bax (A), Bcl-2 (B), TNFR1 (C) and Caspase-8 (D) in HeLa cells

2.2.3 3 種苦味物質對HeLa細胞遷移的影響

圖2 3 種苦味物質對HeLa細胞遷移的抑制Fig. 2 Three bitter substances inhibited HeLa cells migration

圖3 3 種苦味物質對HeLa細胞相對遷移率的影響Fig. 3 Effects of the three bitter substances on relative mobility of HeLa cells

圖2 、3細胞劃痕實驗結果顯示了3 種苦味物質對HeLa細胞遷移的抑制和相對遷移率的影響。諾米林處理HeLa細胞24 h和48 h后，HeLa細胞相對遷移率極顯著降低（P＜0.01），表明諾米林顯著降低了HeLa細胞的遷移能力（圖2中50 μmol/L諾米林處理24、48 h和圖3C）。檸檬苦素處理HeLa細胞24 h后，對照組遷移距離較實驗組遠（圖2中50 μmol/L檸檬苦素處理24 h），HeLa細胞相對遷移率極顯著降低（P＜0.01），但48 h后HeLa細胞遷移能力較對照組沒有顯著差異（圖3A），可能是培養(yǎng)基中有血清導致結果受到增殖的影響。柚皮苷處理HeLa細胞24 h和48 h后，HeLa細胞相對遷移率極顯著降低（P＜0.01）（圖2中50 μmol/L柚皮苷處理24、48 h和圖3B），因此，柚皮苷顯著降低了HeLa細胞的遷移能力。

3 討 論

本研究以高臺蜜柚種子和白色海綿層為原料，分別進行檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的提取、分離純化和檢測。檸檬苦素類似物和柚皮苷的提取率分別為5.21 mg/g和7.72 mg/g，檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的純度分別為94.08%、93.91%和93.39%。

檸檬苦素、諾米林和柚皮苷均選擇50 μmol/L工作濃度，通過體外培養(yǎng)HeLa細胞，研究其對HeLa細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響，以不同方式探討3 種苦味物質對HeLa細胞的作用機制：柚皮苷和檸檬苦素均能顯著促進HeLa細胞凋亡，柚皮苷和諾米林均能抑制HeLa細胞增殖，3 種苦味物質均能顯著抑制HeLa細胞遷移。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，柑橘及其制品中的苦味物質對不同癌細胞的增殖均有顯著抑制作用。宋淑慧等發(fā)現(xiàn)40 μmol/L柚皮苷能抑制人卵巢癌SKOV3細胞株增殖，猜測是通過下調COX-2 mRNA及其蛋白表達而達到抗腫瘤作用[22]。胡昕等除了發(fā)現(xiàn)40 μmol/L柚皮苷對人卵巢癌SKOV3細胞株增殖的顯著抑制作用外，還發(fā)現(xiàn)其促使P38 MARK和ERK1/2蛋白表達下調[23]。鄒連生發(fā)現(xiàn)檸檬苦素類似物顯著抑制人肝癌和膀胱癌細胞株的增殖，諾米林的抑制率優(yōu)于檸檬苦素，且呈時間-劑量依賴效應，同時對正常體細胞無毒害作用[28]。唐莉莉等發(fā)現(xiàn)30 mg/mL檸檬苦素能通過影響MCF-7細胞周期抑制乳腺癌細胞增殖[29]。張娟娟等發(fā)現(xiàn)2.5 μg/mL檸檬苦素能有效抑制人肝癌細胞株的增殖[12]。大量研究證明3 種苦味物質對癌細胞增殖有抑制作用，本研究通過CCK-8實驗證明了3 種苦味物質對宮頸癌細胞增殖的影響，柚皮苷和諾米林作用24 h后能明顯抑制HeLa細胞增殖，而檸檬苦素抑制作用較弱，不同的檸檬苦素類似物對同一癌細胞的作用效果是有較大差異的。1989年Lam等證明了諾米林在肝臟和小腸黏膜通過誘導谷胱甘肽轉移酶活性從而抑制致癌物質誘導腫瘤發(fā)生的效果明顯，而檸檬苦素的作用較弱[11]。但是Miller等發(fā)現(xiàn)檸檬苦素對口腔癌和皮膚癌的抑制效果卻顯著高于諾米林，目前較為認可的解釋是呋喃環(huán)在其中發(fā)揮作用，但是其具體作用機理還有待進一步研究[7]。

目前，還有部分學者從促凋亡方向對3 種苦味物質的抑癌效果進行研究。張春艷發(fā)現(xiàn)柚皮苷能通過抑制增殖和促進細胞凋亡達到抗腫瘤效應，C4’—OCH3基團在抑制HepG-2細胞增殖中發(fā)揮了重要作用[30]。Yeh等發(fā)現(xiàn)柚皮苷能有效抑制致癌物質對遺傳物質的破壞作用[31]。柚皮苷通過減少腫瘤壞死因子的釋放，抑制細胞壁中的脂多糖釋放從而毒害正常細胞，從而能減少致癌物質對正常體細胞破壞，維持細胞內遺傳基因穩(wěn)定[32]。為探究3 種苦味物質抑制癌癥的作用機制，本研究利用實時定量PCR實驗，對Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、TNFR1、Fas、Cytochrome c基因表達量進行了檢測。檸檬苦素作用于HeLa細胞24 h后基因Bcl-2、Bax表達量極顯著增加（P＜0.01），柚皮苷作用于HeLa細胞后基因Bcl-2表達量極顯著增加（P＜0.01），證明柚皮苷有可能通過內源性途徑抑制細胞凋亡。同時，死亡受體基因TNFR1表達量有明顯上升趨勢，可能是其外源性凋亡途徑也發(fā)揮了作用；Caspase-8表達量無明顯變化，因此TNFR1不是通過激活Caspase-8而調控外源性凋亡途徑的，而有可能通過激活TNK/AP-1途徑達到外源促凋亡作用。在研究過程中發(fā)現(xiàn)經過3 種苦味物質處理后，HeLa細胞的遷移速率可能變慢，為了證明猜測，進行了細胞劃痕實驗。細胞遷移實驗結果證實3 種苦味物質均能極顯著抑制癌細胞轉移。癌細胞擴散是癌癥治療過程中一大難題，其會導致病征的嚴重，因此如何控制癌細胞擴散和減緩細胞遷移速率至關重要。本研究中還發(fā)現(xiàn)苦味物質作用后癌細胞貼壁較弱，形態(tài)發(fā)生較大變化，活性降低，這也是細胞遷移能力顯著減弱的具體體現(xiàn)。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，柑橘及其制品中3 種苦味物質檸檬苦素、諾米林和柚皮苷對宮頸癌HeLa細胞具有明顯的抑制增殖和促凋亡作用，能夠作為一種潛在的抑制癌癥的藥物原材料進行開發(fā)和研究，實驗結果可為今后的相關探索提供一定的數據支持。