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        利用UPLC-MS/MS研究高Amadori化合物番茄粉的制備工藝

        2019-10-30 09:35:44張淑琴余佳浩張連富
        食品與生物技術(shù)學報 2019年9期
        關鍵詞:組氨酸活度抗氧化劑

        張淑琴, 余佳浩, 張連富

        (江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122)

        Amadori化合物是美拉德反應的前期產(chǎn)物。果蔬原料中的葡萄糖、果糖等還原糖物質(zhì)作為羰基供體,與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)中含有的自由氨基之間發(fā)生羰胺縮合反應,經(jīng)Amadori重排后,形成結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相對穩(wěn)定的關鍵中間產(chǎn)物——1-氨基-1-脫氧-2-酮糖,即Amadori化合物組分,也稱為酮糖胺組分(Ketosamines),其通用組成式為 Fructose-Amino acid[1]。在果蔬加工或儲藏過程中,ACs的檢測能夠為果蔬的品質(zhì)變化提供一定的技術(shù)指標。除此以外,一些Amadori化合物已被證實具有特定的生理功效[2-10]。由于食品,尤其是富含還原糖和氨基酸的食品,在熱加工過程中很容易發(fā)生美拉德反應生成Amadori化合物,而Amadori化合物含量的高低又直接影響熱加工食品的生理活性,因此研究熱加工食品中Amadori化合物的含量變化具有重要意義。

        目前,關于Amadori化合物的研究主要集中在不同食品中Amadori化合物含量的測定[11-14]及傳統(tǒng)加工貯藏過程中Amadori化合物含量變化的監(jiān)控上[15-17],對于如何改進熱處理工藝以提高Amadori化合物含量,又達到產(chǎn)品常規(guī)指標要求的研究尚未見報道。番茄富含還原糖及氨基化合物,相比于其他水果蔬菜更容易形成Amadori化合物。因此作者選擇番茄粉作為試驗原料,以8種Amadori化合物的含量為評價指標,探究了水分活度、溫度、時間、組氨酸添加量、抗氧化劑添加量對Amadori化合物含量的影響,采用正交試驗法對番茄粉熱加工工藝進行優(yōu)化,制備出高Amadori化合物含量的番茄粉,從而為制備高生理活性的番茄制品提供了一種可能。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Glu)、甲硫氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Met)、苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Phe)、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Ala)、纈氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Val)、組氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-His)、精氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Arg)、異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Leu)標準對照品:作者采用化學合成法自制(其結(jié)構(gòu)經(jīng)紅外光譜、三重四級桿質(zhì)譜及核磁共振表征,純度均大于98%);試驗用水:Mili-Q超純水;甲醇、甲酸:美國TEDIA公司產(chǎn)品;番茄粉:實驗室自制;C18固相萃取小柱:美國SEPAX公司產(chǎn)品;UPLC-TQD超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜:美國 Waters公司產(chǎn)品;Masslynx 4.1工作站;電子天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品;FZ102型微型植物粉碎機:上海巖征生物科技有限公司產(chǎn)品。

        1.2 番茄粉中Amadori化合物檢測方法建立

        1.2.1 混合標準溶液的配置精確稱取8種Amadori化合物,超純水溶解,定容于50 mL容量瓶中,得到標準儲備液。取標準儲備液適量并用超純水稀釋定容,按表1配置6種不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液。

        表1 標準工作液質(zhì)量濃度范圍Table 1 Concentrations of standards mg/L

        1.2.2 UPLC-MS/MS條件液相條件:ACQUITY C18柱。A相:甲醇;B相:體積分數(shù)0.1%甲酸水;流量:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃;梯度洗脫程序:初始條件為B相100%,1 min到5 min內(nèi)B相由100%變?yōu)?0%,5 min到6 min內(nèi)B相由90%變?yōu)?0%,6 min到7 min內(nèi)B相由50%變?yōu)?00%,7 min之后B相保持100%,總運行時間13 min。進樣體積:1 μL。

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子電離模式(ESI+),多反應檢測模式(MRM),離子源溫度:120℃;脫溶劑氣溫度:400℃;毛細管電壓:2.5 kV;脫溶劑氣流量:600 L/h;錐孔電壓:30 V;錐孔氣流量:50 L/h;碰撞能量:20 V;質(zhì)量范圍:m/z100~1 000;檢測電壓:1 600 V;高純氮氣(99.999%)。

        1.2.3 樣品的預處理準確稱取4.000 0 g番茄粉于150 ml錐形瓶中,加入5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/L的咖啡因作為內(nèi)標,同時加入45 mL超純水,高速震蕩30 s,在功率100 W的條件下超聲萃取10 min,10 000 r/min冷凍離心10 min,取上清液過C18固相萃取小柱,凈化后的液體用0.22 μm的濾膜,進行UPLC-MS/MS分析。

        1.2.4 提取條件的選擇準去稱取4.000 0 g番茄粉于150 mL錐形瓶中,加入5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/L的咖啡因作為內(nèi)標,同時加入50 mL超純水,高速震蕩30 s,研究提取溶劑(水、甲醇、乙醇)和提取時間對8種Amadori化合物提取得率的影響。

        1.3 高Amadori化合物番茄粉熱處理條件優(yōu)化

        1.3.1 熱處理單因素試驗準確稱取10.000 0 g番茄粉于真空包裝袋中,真空密封,置于水浴鍋中進行加熱處理。研究番茄粉水分活度,加熱溫度,加熱時間,氨基酸添加量及抗氧化劑添加量對8種Amadori化合物生成量的影響。以8種Amadori化合物生成量為評價指標,確定加工工藝。

        1.3.2 正交試驗設計為優(yōu)化熱處理工藝,根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取水分活度,加熱溫度,加熱時間,氨基酸添加量及抗氧化劑添加量為實驗因素,設計五因素四水平的正交試驗,以8種Amadori化合物總量和Fru-His含量為指標,并進行極差分析,選擇最優(yōu)組合,從而確定最高Amadori化合物及Fru-His含量的番茄粉制備工藝。正交設計試驗因素水平見表2。

        表2 正交試驗表Table 2 Orthogonal experiments

        2 結(jié)果與分析

        2.1 超高效液相色譜質(zhì)譜標準品的檢測結(jié)果

        2.1.1 8種Amadori化合物混合標準曲線及色譜圖將1.2.1中的混合標準溶液在1.2.2的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下檢測,圖1顯示了8種Amadori化合物的MRM色譜圖。將目標物與內(nèi)標峰面積之比(Y)和目標物與內(nèi)標質(zhì)量濃度之比(X)進行線性回歸分析,得到標準線性方程、相關系數(shù)及線性范圍,結(jié)果見表3。

        圖1 8種Amadori化合物的MRM色譜圖Fig.1 Typical chromatographic profiles of eight ACs using ACQUITY C18 Column with the addition of internal standard(caffeine) under optimization LC-MS-MS conditions

        表3 標準回歸方程、相關系數(shù)和質(zhì)量濃度線性范圍Table 3 Linearity and detection limit

        2.1.2 回收率試驗采用在番茄粉中加標的方法測定Amadori化合物的回收率。表4顯示,回收率86.54%~101.87%,相對標準偏差1.38%~4.49%,表明該方法具有較好的再現(xiàn)性。

        2.2 番茄粉中Amadori化合物提取條件優(yōu)化

        2.2.1 提取溶劑對提取得率的影響根據(jù)預實驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn)超聲的提取方式更加省時、高效,因此選擇超聲的提取方式,對提取溶劑進行了篩選。試驗結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出水的提取效果明顯高于其他兩種溶劑。這可能是因為Amadori化合物作為一種多羥基化合物,具有很強的極性[18]。根據(jù)“相似相溶”原理,水的提取效果最好,甲醇次之,乙醇最差,所以選擇水為提取溶劑。

        2.2.2 提取時間對提取得率的影響由圖3可知隨著提取時間的增加,Amadori化合物的得率先增大后減小。當提取時間為10 min時,8種Amadori化合物的提取總量最大,除Fru-Met和Fru-Ala以外,其他6種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均為最大值。當提取時間過長時,其他6種Amadori化合物會在超聲的作用下發(fā)生降解,質(zhì)量分數(shù)會有明顯的降低,而上述兩種Amadori化合物的增加量不顯著,因此提取時間應選擇10 min為宜。

        續(xù)表4

        圖2 提取溶劑對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.2 Effect of solvent on Amadori Compounds yield

        圖3 提取時間對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.3 Effect of extraction time on Amadori Compounds yield

        2.3 高Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)番茄粉熱處理工藝優(yōu)化

        2.3.1 番茄粉水分活度對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)影響由圖可知8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均隨著水分活度的增加先增大后減小,當番茄粉的水分活度為0.34時,Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)達到最大值。這是因為氨基酸和葡萄糖發(fā)生脫水反應,經(jīng)Amadori重排生成有活性的極性小分子,是一個可逆反應[18]。當番茄粉的水分活度增大時,不利于脫水反應的發(fā)生,反應向逆方向進行,Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)降低,因此較低的水分活度更有利于Amadori化合物的生成。

        圖4 水分活度對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.4 Effect of different water activity on Amadori Compounds yield

        2.3.2 溫度對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響溫度是影響美拉德反應的重要因素,由圖5可知,隨著溫度的上升,8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均有不同程度的增加,當反應溫度為60℃時,8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)總和達到最大值,同時其中7種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均達到最大值。這可能是因為在一定溫度范圍內(nèi),溫度的升高有利于提高番茄粉中糖和氨基酸的反應活性,使得Amadori化合物的產(chǎn)量逐漸上升。當反應溫度高于60℃時,盡管Fru-Ala的質(zhì)量分數(shù)有微量上升,但其它7種Amadori化合物含量均有顯著降低。Amadori化合物作為美拉德反應的前期產(chǎn)物,它的形成和降解是同時發(fā)生的,在溫度較高的條件下,Amadori化合物的降解速率大于生成速率,會進一步反應生成類黑素等后期產(chǎn)物。故反應溫度選擇60℃為宜。

        圖5 溫度對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.5 Effectofdifferenttemperatureon Amadori Compounds yield

        2.3.3 時間對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響從圖6可以看出隨著加熱時間的增大,Amadori化合物的含量有一個明顯上升的過程,當加熱時間超過4 h時,8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均有明顯下降,尤其是Fru-Glu和Fru-His的含量顯著降低。這可能是因為隨著加熱時間的增加,Amadori化合物繼續(xù)參與反應生成類黑素等晚期糖基化產(chǎn)物。故番茄粉的加熱時間應選擇4 h。

        圖6 時間對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.6 Effect of different heating time on Amadori Compounds yield

        2.3.4 組氨酸添加量對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fru-Glu和Fru-His可以有效抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性[6]。目前,常用抑制ACE的活性來治療高血壓。由試驗可知Fru-Glu是番茄粉中的質(zhì)量分數(shù)最高的Amadori化合物,而Fru-His含量較低,因此選擇外源添加組氨酸的方法來提高番茄粉中Fru-His的含量,從而提高番茄粉的生物活性。由圖7可知,隨著組氨酸添加量的不斷增加,F(xiàn)ru-His的含量逐漸上升。當組氨酸的添加量為4 mg/g時,8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)達到最大值;當組氨酸的添加量大于4 mg/g時,其他7種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均有明顯的降低。這可能是因為組氨酸的反應活性較高,優(yōu)先與葡萄糖發(fā)生反應,從而使得其他7種氨基酸與葡萄糖發(fā)生反應的速率下降。因此組氨酸的添加量為4 mg/g。

        圖7 組氨酸添加量對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.7 Effect ofL-Histidine on Amadori Compounds yield

        2.3.5 抗氧化劑添加量對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響通過預實驗,選擇茶多酚作為抗氧化劑來抑制美拉德后期反應的發(fā)生。由圖8可知,當抗氧化劑的添加量在0~0.06 mg/g時,8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均隨著抗氧化劑的增加而增加。這可能是因為茶多酚能夠清除美拉德反應中產(chǎn)生的自由基,從而抑制美拉德后期褐色產(chǎn)物的生成,促進前期Amadori化合物的生成[19]。當抗氧化劑的添加量大于0.06 mg/g時,8種Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)隨著抗氧化劑的增加而明顯降低,尤其是Fru-Glu和Fru-His的質(zhì)量分數(shù)明顯降低。這是因為茶多酚的化學結(jié)構(gòu)使其可能會參與美拉德后期產(chǎn)物的形成,當抗氧化劑的質(zhì)量分數(shù)超過一定范圍時,反而有利于美拉德后期產(chǎn)物的生成,從而減少Amadori化合物的形成。故抗氧化劑的添加量應選擇0.06 mg/g為宜。

        2.3.6 正交試驗結(jié)果與分析根據(jù)單因素結(jié)果,在正交試驗中,考慮到Fru-His的高生理活性,故以8種Amadori化合物總質(zhì)量分數(shù)和Fru-His質(zhì)量分數(shù)為評價指標,考察了各因素對Amadori化合物總質(zhì)量分數(shù)和Fru-His質(zhì)量分數(shù)的影響情況。正交試驗設計及結(jié)果如表5所示。

        圖8 抗氧化劑添加量對Amadori化合物質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.8 Effect of antioxidants on Amadori Compounds yield

        采用綜合平衡分析法對結(jié)果進行分析。比較表中的極差R值可知,對Amadori化合物總量影響因素主次是E>B>C>A>D,即關鍵影響因素為抗氧化劑添加量、溫度和時間,其他為次要因素,由K值大小可知因素最優(yōu)水平組合為B1C3E1;對Fru-His含量影響因素主次是E>A>C>B>D,即關鍵影響因素為抗氧化劑添加量、水分活度,由K值大小可知因素最優(yōu)的水平組合為A4E1。因此較優(yōu)熱處理工藝為A4B1C3E1,由于Amadori化合物總質(zhì)量分數(shù)為相對重要的指標,故因素D選擇D1。綜上所述分析,最佳的生產(chǎn)工藝應為A4B1C3D1E1,即抗氧化劑添加量為0.048 mg/g,反應溫度為54℃,反應時間為4.2 h,水分活度為0.44,組氨酸添加量為2.8 mg/g。

        表5 正交試驗表及結(jié)果Table 5 Design and the results of the orthogonal experiments

        2.3.7 驗證試驗按照A4B1C3D1E1條件進行3次放大平行試驗,總Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)均值為152.59 mg/g,F(xiàn)ru-His質(zhì)量分數(shù)為 3.32 mg/g,質(zhì)量分數(shù)均有提高,證明工藝有效。

        3 結(jié) 語

        在利用UPLC-MS/MS方法檢測果蔬制品中Amadori化合物含量的基礎上,進一步優(yōu)化了番茄粉的前處理提取條件,研究結(jié)果顯示以水為提取溶劑,超聲提取10 min時,Amadori化合物的提取得率最高。同時探討了高Amadori化合物番茄粉的制備工藝,以8種Amadori化合物總質(zhì)量分數(shù)及Fru-His的質(zhì)量分數(shù)為評價標準,通過單因素及正交試驗分析了影響番茄粉中8種Amadori化合物生成量的因素,進而得到了最佳的熱處理工藝:抗氧化劑添加量0.048 mg/g,反應溫度54℃,反應時間4.2 h,水分活度0.44,組氨酸添加量2.8 mg/g。在此條件下,總Amadori化合物的質(zhì)量分數(shù)為152.59 mg/g,F(xiàn)ru-His質(zhì)量分數(shù)為3.32 mg/g。該方法為制備富含Amadori化合物的番茄粉奠定了基礎。

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