寧 奇， 孫培冬*， 曹光群， 張 晨， 鄔鳳娟

（1．江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529156）

山藥具有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，現(xiàn)代藥理研究表明山藥具有多種生物活性，山藥的開發(fā)利用具有巨大潛力[1-10]。

粗提的植物多糖中蛋白質(zhì)為主要雜質(zhì)，蛋白質(zhì)的存在不僅會(huì)導(dǎo)致多糖純度的下降，而且會(huì)干擾多糖性能的測(cè)定。酶法脫蛋白質(zhì)優(yōu)于Sevage法、三氯乙酸（TCA）法等常用脫蛋白質(zhì)方法，其反應(yīng)條件溫和，同時(shí)具有較高的蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率。作者以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以蛋白脫除率和多糖保留率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化山藥粘液質(zhì)多糖的脫蛋白質(zhì)工藝條件，并對(duì)純化后的山藥粘液質(zhì)多糖的抗氧化活性和保濕性進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥：市售；牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶：均為生物試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；LyoQuest-85冷凍干燥機(jī)：西班牙泰事達(dá)公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山藥粘液質(zhì)多糖的提取將新鮮山藥洗凈去皮后切片，稱重，加入組織搗碎機(jī)中，按0.5 mL/g的比例加入去離子水，粉碎10 min，得山藥勻漿；將山藥勻漿稱重后用高速離心機(jī)離心，速度為8 000 r/min，時(shí)間為40 min；離心后取上層清液，得山藥粘液質(zhì)原液。

取適量山藥粘液質(zhì)原液于燒杯中，向燒杯中加入4倍體積的無水乙醇，邊緩慢加入、邊攪拌，將攪勻后的混合溶液置于4℃的冰箱中，沉降過夜，離心取下層沉淀，沉淀用無水乙醇洗兩次，丙酮洗1次，將洗后的沉淀放入真空干燥箱中于45℃干燥4 h，得山藥粘液質(zhì)粗多糖。

1.3.2 脫蛋白質(zhì)工藝評(píng)價(jià)方法采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以牛血清蛋白的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，595 nm處所測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，得到牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定樣品中多糖質(zhì)量濃度，以葡萄糖的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，490 nm處所測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[11]。

評(píng)價(jià)脫蛋白質(zhì)方法的兩個(gè)主要指標(biāo)為蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率，其計(jì)算方法如公式（1）和（2）所示；綜合評(píng)分的計(jì)算方法如公式（3）所示。

式中：W1為蛋白質(zhì)脫除率（%），m1為脫蛋白質(zhì)后多糖質(zhì)量，m2為脫蛋白前多糖質(zhì)量。

式中，W2為多糖保留率（%），m3為脫蛋白質(zhì)后多糖質(zhì)量，m4為脫蛋白前多糖質(zhì)量。

式中：A為綜合評(píng)分，W1，max為蛋白脫除率中最大值，W2，max為多糖保留率中最大值。

1.3.3 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)比較4種蛋白酶脫蛋白效果，確定較優(yōu)蛋白酶；在該蛋白酶的最適溫度下分別考察pH、酶底質(zhì)量比、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對(duì)蛋白脫除率和多糖保留率的綜合影響，以此來確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)蛋白脫除率和多糖保留率的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果影響差異性最顯著的3個(gè)因素為變量，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析[11-12]；固定其余酶解的條件。

采用Design-Expert系統(tǒng)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，建立綜合評(píng)分與各因素關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，并通過對(duì)模型的分析來獲得較優(yōu)的酶解工藝條件。

1.3.5 抗氧化活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13-15]測(cè)定山藥粘液質(zhì)多糖對(duì)DPPH自由基、OH自由基和過氧化氫的清除效果，分析山藥粘液質(zhì)的抗氧化活性[16]。

1.3.6 保濕性研究

1）吸濕率 準(zhǔn)確稱取山藥粘液質(zhì)和透明質(zhì)酸鈉各0.100 g，每種樣品需做3份平行，將樣品放入相對(duì)濕度為43%的密閉容器內(nèi)吸濕，放入后開始計(jì)時(shí)，每6 h稱重1次，分別計(jì)算各個(gè)時(shí)間下的吸濕率。使用同樣的方法測(cè)定相對(duì)濕度為81%的環(huán)境下的吸濕率與時(shí)間的關(guān)系。

式中：W3為吸濕率（%），D0為吸濕前樣品的質(zhì)量；D1為吸濕后樣品的質(zhì)量。

2）保濕率 分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的山藥粘液質(zhì)多糖和透明質(zhì)酸鈉溶液；準(zhǔn)確稱取配制好的溶液各0.300 g，每種樣品需做3份平行，將樣品放入相對(duì)濕度為43%的密閉容器內(nèi)保濕，放入后開始計(jì)時(shí)，每6 h稱重1次，分別計(jì)算各個(gè)時(shí)間下的吸濕率；使用同樣的方法測(cè)定相對(duì)濕度為81%的環(huán)境下的保濕率與時(shí)間的關(guān)系。

式中：W4為保濕率（%），H0為保濕劑中水分初始質(zhì)量；H1為保濕劑中水分最終質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，如圖1（a）所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=5.255x+0.067 3（R2=0.999 8）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)濃度下呈線性相關(guān)，如圖1（b）所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=11.38x+0.063 8（R2=0.999 5）。

2.2 蛋白酶種類篩選

分別在4種不同蛋白酶的最佳酶解條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，如圖2所示，胰蛋白酶是這4種蛋白酶中的最優(yōu)蛋白酶。

圖1 蛋白質(zhì)和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein and glucose

2.3 酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率均隨酶底質(zhì)量比的增大而增加，酶底質(zhì)量比為30%時(shí)效果最佳；pH、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的綜合影響較為顯著。因此固定酶底質(zhì)量比為30%，選定pH、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比為變量，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。變量 pH（A）、時(shí)間（B）和液料體積質(zhì)量比（C）的因素水平見表1。

圖2 酶法脫蛋白質(zhì)結(jié)果Fig.2 Deproteinization effect by enzyme method

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程，綜合評(píng)價(jià)用Y表示，則回歸模型的方程式為：

2.4.2 交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響圖4～6為pH、時(shí)間和液料質(zhì)量體積比之間的交互影響的等高圖和響應(yīng)面。

2.4.3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一步確定各因素對(duì)山藥粘液質(zhì)多糖酶解脫蛋白質(zhì)的影響，對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3，由表可知，模型的F=132.88，模型顯著；P（＜0.000 1）＜0.01，差異極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.012 2，顯著；決定系數(shù)R2=0.9867，說明響應(yīng)值的變化有98%以上來源于所選因素，模型擬合度好，回歸方程能很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，該試驗(yàn)方法可靠。

在以上的回歸模型中，一次項(xiàng)的有A、C，二次項(xiàng)、A2、B2和C2的P值均小于 0.01，說明 pH、液料比以及3個(gè)因素的二次項(xiàng)都具有顯著影響。二次項(xiàng)AC、BC的P值小于0.01，說明pH與液料體積質(zhì)量比的相互影響、時(shí)間與液料體積質(zhì)量比的相互影響都極為顯著。B的P值小于0.05，大于0.01，說明時(shí)間的影響顯著。AB的P值大于0.05，說明pH與時(shí)間的相互影響較小。一次項(xiàng)中各因素對(duì)山藥粘液質(zhì)酶解影響顯著性大小順序是：pH＞液料體積質(zhì)量比＞時(shí)間。通過響應(yīng)面優(yōu)化得出最佳酶解條件為pH=8.0，時(shí)間2.0 h，液料體積質(zhì)量比80 mL/g，酶底質(zhì)量比30%，溫度37℃；該條件下的蛋白質(zhì)脫除率為83.4%，多糖保留率為92.7%。

圖3 pH、酶底質(zhì)量比、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對(duì)蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.3 Effects of pH，E/S ratio，time and liquid-to-solid ratio on protein removal rate and the polysaccharide retention time

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and the result

圖4 pH和時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分交互作用的等高圖和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plots and response surface showing the effect of pH and time on the comprehensive score

圖5 pH和液料體積質(zhì)量比對(duì)綜合評(píng)分交互作用的等高圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plots and response surface showing the effect of pH and liquid-to-solid ratio on the comprehensive score

圖6 時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對(duì)綜合評(píng)分交互作用的等高圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plots and response surface showing the effect of time and liquid-to-solid ratio on the comprehensive score

2.5 抗氧化活性的測(cè)定

由圖7可知，山藥粘液質(zhì)多糖對(duì)DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，其IC50值為1.10 mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到80.9%；山藥粘液質(zhì)多糖清除過氧化氫的能力較強(qiáng)，其IC50值為0.24 mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到87.0%；山藥粘液質(zhì)多糖清除OH自由基的能力較弱，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到8.0 mg/mL時(shí)，其OH自由基的清除率曲線逐漸趨于平緩，此時(shí)的OH自由基清除率只有32.5%。

2.6 保濕性研究

2.6.1 吸濕率如圖8（a）所示，當(dāng)相對(duì)濕度為43%，開始時(shí)透明質(zhì)酸鈉的吸濕率略高于山藥粘液質(zhì)多糖，當(dāng)時(shí)間大于48 h，山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率略高于透明質(zhì)酸鈉；如圖8（b）所示，當(dāng)相對(duì)濕度為81%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率略高于透明質(zhì)酸鈉的吸濕率。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA analysis of the fitted quadratic polynomial model

圖7 山藥粘液質(zhì)多糖DPPH自由基、OH自由基和H2O2清除能力Fig.7 DPPH radical、OH radicalandH2O2radical scavenging capacities of yam mucilage polysaccharide

圖8 相對(duì)濕度為43%和81%時(shí)吸濕率與時(shí)間的關(guān)系Fig.8 Moisture absorption rate with time at 43%and81%relative humidity

2.6.2 保濕率當(dāng)相對(duì)濕度為43%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖和透明質(zhì)酸鈉的保濕率相近；當(dāng)相對(duì)濕度為81%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖的保濕率略高于透明質(zhì)酸鈉。

3 結(jié) 語

響應(yīng)面法優(yōu)化山藥粘液質(zhì)多糖脫蛋白工藝結(jié)果表明，最佳脫蛋白工藝為pH 8.0，時(shí)間2.0 h，液料體積質(zhì)量比80 mL/g，酶底質(zhì)量比30%，溫度37℃；該條件下的蛋白質(zhì)脫除率為83.4%，多糖保留率為92.7%。研究表明，山藥粘液質(zhì)多糖具有抗氧化活性，其對(duì)DPPH自由基和過氧化氫的清除率均可達(dá)到80%以上，對(duì)OH自由基的清除能力較弱。當(dāng)相對(duì)濕度為43%時(shí)，透明質(zhì)酸鈉和山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率和保濕率接近，當(dāng)相對(duì)濕度為81%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率和保濕率均略高于透明質(zhì)酸鈉，山藥粘液質(zhì)多糖的綜合保濕性能略優(yōu)于透明質(zhì)酸鈉。因此，將山藥粘液質(zhì)多糖應(yīng)用于化妝品中，可以得到比透明質(zhì)酸鈉保濕性更好的產(chǎn)品。