朱怡霖， 張海生， 趙鑫帥， 薛煥煥， 薛 菁， 孫鈺涵

（陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119）

黑豆是植物中營養(yǎng)豐富的保健佳品，具有延緩衰老等生物活性，酚類物質是重要的生理活性物質[1-6]。橫山老黑豆是榆林地區(qū)重點培育的黑豆品種之一，分析橫山老黑豆中的多酚及其組成成分，并用大孔樹脂分離純化橫山老黑豆生物活性物質[3]。黑豆中含有較高的酚類化合物[7-8]，主要分布于種皮中，黑豆中的酚類化合物遠高于黃豆，鑒定出黑豆中含有沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、香豆酸、綠原酸等酚酸類物質和大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、染料木苷和染料木素等12種異黃酮[7，9-10]。已有研究表明黑豆多酚具有較高的抗氧化、抗腫瘤和抑制前列腺增生等生物活性，但黑豆多酚的分離純化和鑒定方面的研究鮮見報道[11-14]。大孔吸附樹脂具有物理化學穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、再生處理方便、節(jié)省費用等優(yōu)點，是一種常用有效的分離純化多酚物質的方法[14-16]。不同物質的多酚物質種類及含量差異較大，不同種類的大孔樹脂對酚類物質的分離純化效果也存在較大的差異[17-18]。作者以橫山老黑豆為原料，通過比較8種大孔樹脂對橫山老黑豆酚類化合物的吸附和解吸特性，篩選出對橫山老黑豆酚類化合物具有較好的吸附和解吸性能的樹脂，建立橫山老黑豆多酚物質分離純化工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要儀器

橫山老黑豆：橫山種子公司提供。

大孔樹脂：AB-8、D101、NKA-9 和 NKA-Ⅱ，西安藍曉科技有限公司產品；大孔樹脂：X-5、LSA-21、XDA-1、HPD-700：陜西藍深特種樹脂有限公司產品。

沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸：購自Sigma公司；大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、染料木苷和染料木素購于上海源葉生物科技有限公司。

U-3000高效液相色譜儀-Thermo：美國熱電公司產品；KQ3200DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；Multiskan Go全波長酶標儀：美國熱電公司產品；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫(yī)療器械有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理取一定量橫山老黑豆粉碎過60目篩，準確稱取90 g，加入900 mL石油醚振蕩脫脂24 h，揮干溶劑，用體積分數80%的甲醇以料液體積比1 g∶15 mL于超聲提取儀40℃提取30 min后，3 000 r/min離心15 min后收集上清液，殘渣以同樣方法重復提取2次，合并3次提取液，40℃下真空濃縮得橫山老黑豆多酚粗提液。置于-20℃保存，備用。

1.2.2 多酚的測定方法采用Folin-Ciocalteau法測定多酚含量[19]，準確移取提取液0.1 mL，分別加入0.5 mL蒸餾水和 0.1 mL Folin-Ciocalteu試劑，3 min后加入7.5 g/dL碳酸鈉溶液0.3 mL，于漩渦混合器中混合，置于25℃水浴避光反應2 h，以0.1 mL蒸餾水代替樣品做空白，在760 nm波長處用酶標儀測定吸光度A。以沒食子酸作標準品代替樣品作標準曲線，得到回歸方程y=0.005 1x+0.003，R2=0.999 3。多酚質量分數以沒食子酸的質量分數（GAE）表示，單位為 mg/g。

1.2.3 大孔樹脂的預處理將各樹脂用無水乙醇室溫下密封浸泡24 h，用蒸餾水洗至無醇味，用質量分數5%鹽酸溶液浸泡8 h，蒸餾水洗至中性，再用質量分數5%氫氧化鈉溶液浸泡8 h，蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.4 大孔樹脂的篩選準確稱取各處理好的濕樹脂 AB-8、D101、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、LSA-21、XDA-1和HPD-700各1 g，置于50 mL錐形瓶中，各加入0.11 mg/mL橫山老黑豆樣品提取物10 mL，置于25℃恒溫搖床中振蕩吸附24 h，抽濾，取濾液測定樹脂對總酚的吸附量。取上述吸附飽和樹脂，再分別置于50 mL錐形瓶中，加入10 mL體積分數70%乙醇，置于25℃恒溫搖床振蕩解吸24 h，使樹脂被充分洗脫后，取洗脫液測定吸光度并計算解吸率，選取吸附量、吸附率及解吸率（洗脫率）較高的樹脂。樹脂吸附量、吸附率與洗脫率按如下公式計算[20]：

式中：Q吸附量 （mg/g）；C0吸附前酚類質量濃度；C1吸附后平衡液中酚類質量濃度；V1吸附溶液體積；W樹脂質量 （g）；A吸附率 （%）；D洗脫率（%）；C2洗脫液中酚類濃度；V2洗脫液體積。

1.2.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸試驗乙醇體積分數對靜態(tài)解吸率的影響：準確稱取篩選出來的經處理的濕樹脂5份各1 g，分別置于50 mL錐形瓶中，均加入10 mL橫山老黑豆多酚粗提液，放于25℃恒溫搖床中振蕩24 h，然后將吸附平衡的樹脂取出，過濾，再分別置于50 mL錐形瓶中，加入不同體積分數 （25%、40%、60%、70%和80%）的乙醇溶液10 mL，置于25℃恒溫搖床振蕩解吸24 h，取洗脫液測定吸光度并計算解吸率。

靜態(tài)吸附動力學曲線：準確稱取經處理的濕樹脂1 g，置于50 mL錐形瓶中，加入10 mL橫山老黑豆多酚粗提液，放于25℃恒溫搖床中靜置，每隔30 min振蕩2 min并取100 μL上清液，按照1.2.2的方法測定多酚含量，繪制吸附動力學曲線。

1.2.6 大孔樹脂動態(tài)吸附和解吸試驗將篩選出來的樹脂濕法裝柱（柱長50 cm，D3 cm）。用蒸餾水平衡后，將不同質量濃度（0.49、0.98、1.96 mg/mL）和不同流量（1.50、2.14、3.00 BV/h）的多酚樣品進行上樣，收集流出液并測定不同體積流出液的多酚質量濃度，每20 mL流出液為一管收集并采用Folin-Ciocalteau法測定多酚質量濃度。當流出液中多酚濃度達到上樣液質量濃度的10%時即為泄漏點。吸附平衡后用大量的蒸餾水沖洗，去除水溶性蛋白、還原糖和多糖等雜質，再用體積分數70%乙醇溶液以一定流速洗脫，按照1.2.2的方法測定多酚質量分數。

1.2.7 橫山老黑豆酚酸及異黃酮的HPLC分析采用HPLC法測定經篩選的大孔吸附樹脂分離純化后的橫山老黑豆酚酸及異黃酮的組成和含量變化[21-22]。取上述處理過的樣品1 mL，0.45 μm濾膜過濾。采用 Thermo U-3000 HPLC系統(tǒng)，Diamonsil C 18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。 酚酸的 HPLC條件：流動相乙腈（A）和體積分數1%冰乙酸（B）溶液，檢測波長 280 nm，柱溫30℃，流量1.0 mL/min，進樣量20 μL，HPLC的總運行時間為50 min。梯度洗脫條件：0～5 min，5%～15%A；5～35 min，15%～35%A；35～40 min，35%～45%A；40～50 min，45%～5%A。異黃酮的HPLC條件：流動相乙腈（A）和體積分數0.1%冰乙酸（B）溶液，檢測波長 260 nm，柱溫20 ℃，流量 1.0 mL/min ，進樣量 20 μL，HPLC 的總運行時間為50 min。梯度洗脫條件：0～5 min，5%～15%A；5～35 min，15%～35%A；35～40 min，35%～45%A；40～50 min，45%～5%A。 樣品的定性與定量通過與標品的出峰時間和峰面積來確定。

1.2.8 數據統(tǒng)計分析采用 SPSS 17.0軟件（SPSSInc，Chicago，IL，USA）進行統(tǒng)計分析，數據結果以平均數±標準差（n=3）表示，采用Duncan多元回歸方法分析0.05水平上均值的顯著性差異。

2 結 果

2.1 不同的大孔樹脂對橫山老黑豆多酚吸附和解吸結果

由圖1表明，8種所選樹脂對橫山老黑豆多酚的吸附量存在顯著性差異，NKA-Ⅱ的吸附量最高為 0.73 mg/g，其次為 NKA-9和 HPD-700（吸附量分別為0.67 mg/g和0.65 mg/g），其余5種樹脂的吸附量較低并與以上3種樹脂存在顯著性差異。圖2表明，NKA-9和LSA-21多酚解吸率均較大 （解析率分別為83.52%和85.03%），兩者之間無顯著性差異，NKA-Ⅱ的多酚解吸率最低（58.46%）。綜合考慮大孔樹脂對橫山老黑豆多酚的吸附量和解吸率，NKA-9型大孔樹脂不僅具有較強的吸附性，而且也具有較強的解吸能力，因此選用NKA-9型大孔樹脂進行橫山老黑豆多酚的分離純化研究。

圖1 不同的大孔樹脂對橫山老黑豆多酚的靜態(tài)吸附量比較Fig.1 Comparison ofstaticadsorption capacity of different macroporous resins to polyphenols in Hengshan black soybean

2.2 靜態(tài)吸附、解吸結果

乙醇體積分數對NKA-9樹脂靜態(tài)解吸率的影響如圖3所示，隨著乙醇體積分數的增加，橫山老黑豆多酚的解析率在70%之前逐漸增加，70%以后下降，乙醇體積分數為70%時，多酚解析率最大，因此，選用70%乙醇溶液作為多酚的解吸劑。

NKA-9型大孔樹脂吸附橫山老黑豆多酚的動力學曲線如圖4所示，NKA-9對橫山老黑豆多酚的吸附量在2 h內快速上升，在4 h其吸附多酚的量達到平衡。

圖2 不同的大孔樹脂對橫山老黑豆多酚的靜態(tài)解析率比較Fig.2 Comparison ofstaticdesorption capacity of different macroporous resins to polyphenols in Hengshan black soybean

圖3 乙醇體積分數對靜態(tài)解吸率的影響Fig.3 Influence of ethanol volume fraction on static desorption percentage

圖4 NKA-9樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.4 Adsorption kinetics of NKA-9 macroporous resin

2.3 樣品質量濃度對NKA-9大孔樹脂吸附性能的影響

上樣流量為2.14 BV/h時，樣品質量濃度對NKA-9吸附性能的影響如圖5所示，上樣質量濃度越大泄漏點出現的越早。上樣濃度為0.49 mg/mL時，在12BV體積出現泄漏點，上樣時間過長，工作效率低。上樣質量濃度為0.98 mg/mL和1.96 mg/mL時，泄漏點分別在10 BV和7 BV出現，樹脂吸附量分別為2 744.0 mg和3 841.6 mg。在泄漏點處，上樣質量濃度為1.96 mg/mL時，NKA-9大孔樹脂對橫山老黑豆多酚提取物的吸附量最大，上樣時間短。提取物上樣質量濃度達到2.55 mg/mL時樣品黏度較大容易堵塞層析柱。因此，選取1.96 mg/mL為上樣質量濃度。

圖5 樣品質量濃度對NKA-9樹脂吸附性能的影響Fig.5 Impact of sample concentration on the adsorption properties of NKA-9 resin

2.4 上樣流量對大孔樹脂吸附性能的影響

上樣流量對NKA-9吸附性能的影響如圖6所示，上樣流量越大泄漏點出現越早，上樣流量為3.00、2.14、1.50 BV/h 時， 泄漏點分別在 4、7、11 BV附近出現，樹脂對橫山老黑豆多酚的吸附量分別為1 097.6、1 920.8和 2 744.0 mg?？梢缘贸?，上樣流量為1.50 BV/h時，泄漏點出現最遲，樹脂吸附量最高，但上樣時間太長，不利于實際應用。上樣流量為3.00BV/h時，泄漏點出現較早，但樹脂吸附量較低。上樣流量為2.14 BV/h時，泄漏點出現相對較早，吸附量相對較高。因此，選取2.14 BV/h為最佳的上樣速度。

圖6 樣品質量濃度對NKA-9樹脂吸附性能的影響Fig.6 Impact of sample rate on the adsorption properties of NKA-9 resin

2.5 橫山老黑豆酚酸、異黃酮及單體組成

NKA-9大孔樹脂純化橫山老黑豆酚酸的前后HPLC色譜圖如圖7所示，橫山老黑豆酚酸純化前保留時間5min前的雜峰經NKA-9樹脂純化后雜峰被有效去除，純化前保留時間大于5 min的峰變化不大，所測的8種酚酸（沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸）均被保留，表明NKA-9大孔樹脂適于分離純化橫山老黑豆酚酸。橫山老黑豆中所檢測的8種單體酚酸種類及純化前后的質量分數見表1，其中質量分數最高的是原兒茶酸，占8種酚酸的65.82%，其次是綠原酸和咖啡酸，兩者酚酸的質量分數占8種酚酸的26.60%，以上3種酚酸的質量分數占所測8種酚酸的92.43%。

NKA-9大孔樹脂純化橫山老黑豆異黃酮的前后HPLC色譜圖如圖8所示，橫山老黑豆異黃酮純化前保留時間2～10 min之間存在許多雜峰，經NKA-9純化后雜峰被去除，且所檢測的5種異黃酮（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素）均得到很好的保留，表明NKA-9大孔樹脂適于分離純化所檢測的5種橫山老黑豆異黃酮，但色譜峰中有兩種相對較高的峰在分離純化前后有較大的變化，還有待進一步研究。5種異黃酮種類及純化前后的含量見表2，大豆苷和染料木苷的質量分數較高，占所測5種異黃酮總質量分數的88.87%，保留率也較高均在90%以上。其次是黃豆黃苷，占5種異黃酮的10.55%，保留率為85.26%。

圖7 NKA-9大孔樹脂純化前和后的橫山老黑豆酚酸HPLC譜Fig.7 Chromatograms of phenolic acids of Hengshan black soybean before and after NKA-9 macroporous resin purification

3 討 論

3.1 不同的大孔樹脂對酚類物質吸附性能的影響

大孔吸附樹脂的吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結果。同時由于大孔吸附樹脂的多孔結構使其對分子大小不同的物質具有篩選作用。大孔樹脂對橫山老黑豆多酚類物質的吸附存在一定的選擇性。作者考察了8種不同極性和特性的大孔樹脂，以篩選出吸附量和解析率均較好的大孔樹脂用于分離橫山老黑豆酚類物質。8種樹脂的篩選結果表明，極性的NKA-9和非極性的NKA-Ⅱ都具有較高的吸附性能。由此可見，橫山老黑豆多酚類物質中既具有極性較大的酚類物質也存在非極性的酚類物質。解析率結果表明，非極性的NKA-Ⅱ樹脂的解析性能較低，而極性的NKA-9樹脂卻具有較好的解吸性能，這表明橫山老黑豆酚類物質可能與樹脂的比表面積及平均孔徑關系較大。陶莎等[23]研究了 5種不同型號的大孔樹脂 （S-8、HPD600、D4020、AB-8和NKA-9）對紅小豆多酚的吸附分離效果，結果表明，極性的HPD 600樹脂效果較好。甘芝霖等[17]比較了4種大孔樹脂 （ADS-17、AB-8、NKA-9和D101）對玫瑰果多酚的吸附分離效果，篩選出弱極性的AB-8為最佳的吸附樹脂類型。由此表明，不同物質所含的酚類物質不同，用于酚類物質分離純化的最佳的大孔樹脂的類型差異也較大。

圖8 NKA-9大孔樹脂純化前和后的橫山老黑豆異黃酮HPLC譜Fig.8 Chromatograms of isoflavone of Hengshan black soybean before and after NKA-9 macroporous resin purification

表1 NKA-9樹脂分離純化前后橫山老黑豆酚酸種類及質量分數比較Table 1 Composition and content of phenolic acids of Hengshan black soybean before and after NKA-9 macroporous resin purification

表2 NKA-9樹脂分離純化前后橫山老黑豆異黃酮質量分數的比較Table2 Composition and contentof?isoflavoneof Hengshan black soybean beforeand after NKA-9 macroporous resin purification

3.2 樣品質量濃度和上樣流量對大孔樹脂的影響

樣品濃度及上樣流量也對樹脂的吸附性能產生影響。蘇東曉等[16]研究了樣品質量濃度（3.2、1.6、0.8 和 0.4 mg/mL）和上樣流量（4.5、3.0、1.5 BV/h）對HPD-826吸附荔枝果肉多酚泄漏點和吸附量的影響，結果發(fā)現樣品質量濃度和上樣流量分別為0.8 mg/mL和3.0 BV/h時，吸附效率較高。李瓊等[24]考察了核桃青皮多酚質量濃度（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/mL）和上樣流量（2、3、4 mL/min）對 AB-8 大孔樹脂吸附泄漏曲線的影響，結果發(fā)現樣品質量濃度和上樣速量分別為3、2 mL/min時，AB-8樹脂具有較高的吸附性能。作者分析樣品濃度和上樣流量對NKA-9樹脂分離橫山老黑豆多酚發(fā)現，樣品質量濃度越大泄漏點出現越早，樹脂吸附量越大，這種現象可能是樣品中多酚質量分數越大與樹脂的接觸機率越高，樹脂對多酚的吸附越多。樣品質量濃度過低會導致上樣時間過長不利于實際應用，質量濃度過大則有可能導致柱子阻塞。上樣流量對NKA-9樹脂分離純化橫山老黑豆多酚也具有很大影響，上樣流量越大泄漏點出現越早，但樹脂吸附量較少。上樣流量過小泄漏點出現時間過長不利于操作，因此選取中等流量進行上樣。

3.3 橫山老黑豆酚類物質組成

利用HPLC方法對橫山老黑豆中酚酸的組成進行了研究，檢測出8種酚酸化合物，其中原兒茶酸是橫山老黑豆的主要酚酸組成物質，占所檢的8種酚類質量分數的50%以上，其次綠原酸和咖啡酸在橫山老黑豆中含量也相對較高。Bi-Ni Wang等[25]對紅棗中的酚酸化合物組成進行了分析，但對黑豆中的酚酸化合物的組成的分析鮮見報道。經NKA-9大孔樹脂純化前后的酚酸的組成及質量分數通過HPLC色譜進行了比較，發(fā)現經過大孔樹脂吸附橫山老黑豆酚酸不會造成單體酚酸組成減少，各種酚酸的質量分數降低也較少。大豆苷和染料木苷是所測的5種異黃酮中質量分數較高的兩種成分。NKA-9大孔樹脂對所測的5種橫山老黑豆異黃酮的分離純化具有良好的效果，質量分數降低也較少。因此，NKA-9樹脂適于分離純化橫山老黑豆酚類物質。

4 結 語

1）通過靜態(tài)吸附和解吸試驗篩選出適用于橫山老黑豆酚類化合物分離純化的大孔樹脂NKA-9。NKA-9樹脂對橫山老黑豆酚類化合物具有良好的吸附和解吸性能。

2)通過動態(tài)吸附試試驗確定了NKA-9大孔樹脂分離純化橫山老黑豆酚類化合物的最佳條件：橫山老黑豆酚類化合物的樣品上樣質量濃度為1.96 mg/mL，上樣流量為2.14 BV/h，乙醇洗脫劑體積分數為70%，洗脫流量為2.14 BV/h。

3)橫山老黑豆中原兒茶酸質量分數較高，大豆苷和染料木苷質量分數也較高。NKA-9大孔樹脂分離純化橫山老黑豆酚酸和異黃酮不會導致單體組成的變化，而且質量分數降低很少。