饒 榕 ， 丁彥蕊

（1.江南大學(xué) 物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 數(shù)字媒體學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

木聚糖酶能夠?qū)⒛揪厶撬鉃樾」烟呛湍径堑鹊途勰咎牵约吧倭康哪咎呛桶⒗?，是造紙、醫(yī)藥、飼料以及食品等領(lǐng)域常用的酶制劑。耐熱木聚糖酶因其能在高溫下保持活性而在工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用。多年來，人們通過序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)分析、定點(diǎn)突變以及分子模擬等方法研究木聚糖酶的耐熱性[1]。目前一些研究表明：鹽橋是穩(wěn)定木聚糖酶結(jié)構(gòu)的主要作用力[2]；芳香族氨基酸的疏水作用增加了結(jié)構(gòu)內(nèi)部的穩(wěn)定性[3]；N端結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[4]、二硫鍵數(shù)目增加[5]以及表面精氨酸含量的增加[6]對(duì)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性也至關(guān)重要；隨著研究的深入，人們又發(fā)現(xiàn)木聚糖酶結(jié)構(gòu)中存在熱穩(wěn)定區(qū)[7-8]，這充分表明了木聚糖酶序列和結(jié)構(gòu)因素之間通過協(xié)同作用來提高熱穩(wěn)定性[9]。

將蛋白質(zhì)編碼為氨基酸網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)角度分析影響蛋白質(zhì)耐熱性的各因素之間的關(guān)系，是闡明蛋白質(zhì)耐熱機(jī)制的有效方法。作者構(gòu)建了不同類型的Fe-SOD酶的氨基酸-氨基酸相互作用網(wǎng)絡(luò)并研究網(wǎng)絡(luò)中的hub節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)耐熱Fe-SOD酶中hub是疏水的甘氨酸和亮氨酸，這些殘基形成較強(qiáng)的疏水核心，提高了Fe-SOD酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[10]。另外，還發(fā)現(xiàn)耐熱的Fe-SOD酶的平均度、平均連接強(qiáng)度等網(wǎng)絡(luò)參數(shù)要高于常溫的Fe-SOD酶[11]。Srivastava等通過結(jié)合復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論和動(dòng)態(tài)研究方法找到了對(duì)枯草芽孢桿菌脂肪酶耐熱性影響的重要?dú)埢鵞12]。Brinda等人也通過網(wǎng)絡(luò)的方法發(fā)現(xiàn)了耐熱蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)與耐溫蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)之間的差異[13]。

水合作用協(xié)助蛋白質(zhì)內(nèi)部的共價(jià)及非共價(jià)相互作用維系了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[14-17]。水分子-蛋白質(zhì)的相互作用還影響著蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[18]。耐熱蛋白質(zhì)表面往往分布著豐富的帶電荷殘基，這些殘基除了容易形成鹽橋以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)外，還容易與水分子形成氫鍵以保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[19]。作者研究了耐熱性不同的Fe-SOD酶與水的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)嗜熱Fe-SOD酶能與水形成更多的氫鍵，蛋白質(zhì)與水以及水與水之間形成了氫鍵網(wǎng)絡(luò)來包裹蛋白質(zhì)[20]。Sterpone等人通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了不同溫度下水對(duì)熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)于嗜熱蛋白質(zhì)，水能提高蛋白質(zhì)內(nèi)部的靈活性和結(jié)構(gòu)的魯棒性[16]。此外，在耐熱蛋白質(zhì)表面有大量親水性氨基酸與水接觸，還有大量鹽橋網(wǎng)絡(luò)在蛋白質(zhì)-水界面上，帶電氨基酸在蛋白質(zhì)-水界面的分布對(duì)熱穩(wěn)定性起到了重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵隨著溫度的上升而下降，而嗜熱蛋白質(zhì)會(huì)通過與水接觸來補(bǔ)償[17]。Oleinikova通過研究水分子與氨基酸之間的氫鍵能量，發(fā)現(xiàn)在307 K時(shí)（這個(gè)溫度下生物體的生物活性最大），水與蛋白質(zhì)表面形成的水化層對(duì)于能量是非常敏感的，而某些多肽結(jié)構(gòu)是不敏感的，不敏感的多肽結(jié)構(gòu)表明，熱穩(wěn)定性是由水與多肽合作形成水化的肽鏈來影響的。從而發(fā)現(xiàn)水對(duì)熱穩(wěn)定性的作用[21]。

作者通過Voronoi算法[22]識(shí)別出與木聚糖酶的氨基酸殘基相互作用的水，然后確定殘基與水之間的相互作用以及殘基-殘基之間的相互作用。以氨基酸殘基和水為節(jié)點(diǎn)，殘基與殘基、以及殘基與水之間的相互作用為邊構(gòu)建無加權(quán)氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)。接下來，通過計(jì)算比較木聚糖酶氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鱽硌芯克畬?duì)木聚糖酶耐熱性的影響。另外，以hub水為中心進(jìn)行聚類，確定連接到該hub水的超過某一特定閾值的氨基酸殘基，并進(jìn)一步分析子網(wǎng)的特性以及水與氨基酸殘基之間的關(guān)系，將利用殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)確定水分子與木聚糖酶的耐熱性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集及分子動(dòng)力學(xué)模擬

以來自Thermoascus aurantiacus（T.aurantiacus，簡(jiǎn)寫為T.aur）的耐熱木聚糖酶和來自Streptomyces lividans（S.lividans，簡(jiǎn)寫為S.liv）的常溫木聚糖酶為研究對(duì)象。首先利用分子動(dòng)力學(xué)模擬獲得它們?cè)?00、325、350、375 K下的構(gòu)象。分子動(dòng)力學(xué)模擬是在CHARMM27力場(chǎng)下，在含有8 841個(gè)水分子的水盒子中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的[9]。在每個(gè)溫度下得到300 ns軌跡數(shù)據(jù)，獲得了所有原子的坐標(biāo)信息。每隔1 ns保存一個(gè)構(gòu)象信息，這樣每個(gè)溫度下按照模擬時(shí)間順序保存了300個(gè)三維結(jié)構(gòu)。

1.2 識(shí)別與木聚糖酶相互作用的水分子的Voronoi算法描述

Voronoi圖是由一組連接兩個(gè)相鄰的點(diǎn)的直線的垂直平分線組成的連續(xù)多邊形。由于要識(shí)別與氨基酸殘基有相互作用的水，首先將氨基酸殘基和水都看作節(jié)點(diǎn)，然后對(duì)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)按照最鄰近原則劃分平面，為每個(gè)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)分配一個(gè)區(qū)域（稱為Voronoi細(xì)胞）。然后根據(jù)水的三維坐標(biāo)信息，篩選出在氨基酸殘基區(qū)域中的水分子。采用Voronoi算法分析木聚糖酶中的氨基酸殘基與水之間的關(guān)系，準(zhǔn)確的給所有的氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)分配空間，通過篩選區(qū)域中的水來識(shí)別與殘基相互作用的水分子。

具體算法描述如下：隨機(jī)選定一個(gè)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)，計(jì)算其最鄰近的兩個(gè)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)，三者組成一個(gè)Delaunay三角形。遍歷所有的氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)，做出每個(gè)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)的Delaunay三角形。每個(gè)Delaunay三角形內(nèi)部不包含任何氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)；分別做出每個(gè)Delaunay三角形三條邊的垂直平分線，并計(jì)算出它們的中心；連接所有三角形中心，這些連線就構(gòu)成了Voronoi多邊形。相應(yīng)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)就是Voronoi多邊形的中心。保存每個(gè)Voronoi多邊形信息；對(duì)于每個(gè)Voronoi多邊形，統(tǒng)計(jì)多邊形區(qū)域內(nèi)部的水分子，即為與該多邊形中心的氨基酸殘基存在相互作用的水分子。

上述算法中，Delaunay三角形是由與Voronoi多邊形共享一條邊的相關(guān)點(diǎn)連接而成的三角形，每個(gè)Voronoi多邊形對(duì)應(yīng)一個(gè)氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)。相比于常用的基于距離篩選水的方法，Voronoi算法能夠確定那些與氨基酸殘基距離較遠(yuǎn)卻存在相互作用的水分子，數(shù)據(jù)更可靠。

1.3 構(gòu)建殘基-水相互作用無加權(quán)網(wǎng)絡(luò)

計(jì)算氨基酸殘基a與氨基酸殘基b（a≠b）的重原子之間的距離，當(dāng)距離在6.5×10-4m以內(nèi)時(shí)，認(rèn)為氨基酸殘基a與氨基酸殘基b之間存在相互作用[23]。氨基酸殘基與水之間的相互作用根據(jù)上述Voronoi算法確定。以氨基酸殘基和水為節(jié)點(diǎn)，殘基與殘基、以及殘基與水的相互作用為邊構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的計(jì)算

計(jì)算了平均度（degree）、平均無加權(quán)聚類系數(shù)（clustering coefficient）、平均接近中心性（closeness centrality）、平均節(jié)點(diǎn)中心性（Residue centrality）這些網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。具體計(jì)算公式如下：

網(wǎng)絡(luò)平均度：

其中，ki為節(jié)點(diǎn)i的度代表節(jié)點(diǎn)i與j之間的邊，若有邊為1，無邊為0。N為網(wǎng)絡(luò)中的水節(jié)點(diǎn)數(shù)目。

聚類系數(shù)C[24]：

其中，ei為節(jié)點(diǎn)i的鄰居節(jié)點(diǎn)之間的實(shí)際邊數(shù)，ki為節(jié)點(diǎn)i的度。

節(jié)點(diǎn)水的平均接近中心性CC[24]：

水的節(jié)點(diǎn)中心性ΔLk：

1.5 基于hub水的殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)聚類

網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間往往會(huì)形成簇來共同完成某項(xiàng)功能。在木聚糖酶的氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中，水分子與哪些氨基酸殘基或者水分子形成簇以及水分子如何影響殘基-殘基相互作用，需要對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析獲得。以hub水為聚類中心，設(shè)置閾值，獲得該水分子的簇。

其算法描述如下：

計(jì)算氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)的度，將度為2的水設(shè)定為hub水；將hub水放在隊(duì)列H中，從隊(duì)列的第一個(gè)節(jié)點(diǎn)（第一個(gè)水）開始，找出與第一個(gè)水相連接的殘基，如果殘基的度大于等于設(shè)定的閾值K（K=18）時(shí)，將該殘基放入子網(wǎng)中；以此殘基為中心，遍歷其所有鄰居氨基酸殘基，如果鄰居殘基的度大于閾值K，那么就將該鄰居殘基放入子網(wǎng)中；重復(fù)步驟3，直到遍歷網(wǎng)絡(luò)中所有的殘基為止。在該子網(wǎng)中，重新回溯整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)中原先與殘基相連接的水加入到子網(wǎng)中。重復(fù)步驟2～4，找出已知隊(duì)列中所有hub水的子網(wǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 木聚糖酶中與氨基酸殘基相互作用的水分子分布

如方法部分所述，每個(gè)模擬溫度下的木聚糖酶的構(gòu)象有300個(gè)，根據(jù)每個(gè)構(gòu)象的原子坐標(biāo)信息，利用Voronoi算法識(shí)別出了與氨基酸殘基存在相互作用的水分子。統(tǒng)計(jì)不同模擬溫度下水分子數(shù)在300個(gè)構(gòu)象中的占比，然后比較不同耐熱性的木聚糖酶中水分子比例可以確定水分子數(shù)與耐熱性的關(guān)系，結(jié)果見圖1。

對(duì)于耐熱木聚糖酶以及常溫木聚糖酶，與氨基酸殘基相互作用的水分子數(shù)會(huì)隨著溫度的上升而減少，特別是350 K到375 K過程中，常溫木聚糖酶中水分子的數(shù)量急劇減少，這說明高溫減弱了常溫木聚糖酶中水分子與殘基之間的相互作用[21]。而對(duì)于耐熱木聚糖酶和常溫木聚糖酶在同一個(gè)溫度下比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)嗜熱木聚糖酶中水分子的數(shù)量比常溫木聚糖酶中要多，并且隨著溫度升高，水分子的數(shù)量差異也越明顯。可見，嗜熱木聚糖酶中氨基酸殘基與水分子相互作用比常溫木聚糖酶更密切，嗜熱木聚糖酶中的氨基酸與水形成更多的氫鍵來抵御高溫[21]。

圖1 與耐熱和常溫木聚糖酶存在相互作用的水分子在不同模擬溫度下的分布Fig.1 Distribution of waters interacting with residues of thermostable and mesophilic xylanase at different simulated temperatures

2.2 木聚糖酶中hub水分子的數(shù)量隨模擬時(shí)間和溫度的變化

由于水的化學(xué)特性決定了與蛋白質(zhì)相互作用的水分子最多能形成兩個(gè)氫鍵，因此將網(wǎng)絡(luò)中度為2的水看作是hub水，相對(duì)于度為1的水，它對(duì)蛋白質(zhì)的影響更為重要。圖2表明，隨著溫度的升高，耐熱木聚糖酶和常溫木聚糖酶中hub水分子的數(shù)量不斷降低。但是對(duì)于某一特定溫度，嗜熱木聚糖酶中hub水分子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常溫木聚糖酶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)度為2的hub水分子數(shù)量在50 ns之后隨著時(shí)間的變化保持不變，說明雖然分子間是不停運(yùn)動(dòng)的，但是有一些氨基酸殘基始終與水發(fā)生相互作用，并保持緊密聯(lián)系[17]。

圖2 氨基酸-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中hub水分子數(shù)量隨模擬時(shí)間和溫度的變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of hub water number over time and temperature in residue-water interaction network

2.3 木聚糖酶氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中水的網(wǎng)絡(luò)特性

圖3 分別是從4個(gè)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的角度分析水在網(wǎng)絡(luò)中的參與程度。對(duì)于平均度（圖3（a）），平均聚類系數(shù)（圖 3（b）），平均接近中心性（圖 3（c）），平均節(jié)點(diǎn)中心性（圖3（d）），從圖中可以看出，在同一溫度下，嗜熱木聚糖酶中水分子的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)比常溫木聚糖酶中水分子的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)要高，說明這些網(wǎng)絡(luò)屬性與木聚糖酶熱穩(wěn)定性之間存在正相關(guān)關(guān)系。平均度、平均聚類系數(shù)、平均接近中心性、平均節(jié)點(diǎn)中心性分別從與氨基酸殘基的連接程度、鄰居節(jié)點(diǎn)的聚集程度、與殘基接近的程度、以及水分子如何從全局影響整個(gè)網(wǎng)絡(luò)這4個(gè)角度反映水分子在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的貢獻(xiàn)以及參與程度。在300 K和325 K下，嗜熱木聚糖酶中水分子的平均度以及平均接近中心性都有顯著增加，而常溫木聚糖酶的這些網(wǎng)絡(luò)參數(shù)卻在減少。這些現(xiàn)象表明，隨著溫度升高，與常溫木聚糖酶相比，嗜熱木聚糖酶中某些氨基酸殘基與水形成更多的氫鍵，通過水合作用形成水化的肽鏈來穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[21]。在325 K時(shí)，耐熱木聚糖酶中水分子的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)和常溫木聚糖酶的差異尤為明顯，耐熱木聚糖酶中水分子的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)要比常溫木聚糖酶高很多。這表明水分子不僅能和嗜熱木聚糖酶中的氨基酸殘基形成氫鍵來穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸殘基的相互作用，提高蛋白質(zhì)內(nèi)部的靈活性和魯棒性[16]。 在其他溫度下，水分子在嗜熱木聚糖酶氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)的貢獻(xiàn)也比在常溫木聚糖酶大，它們與殘基之間的作用也更加緊密[20]。

圖3 木聚糖酶氨基酸-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中水的拓?fù)鋮?shù)Fig.3 Distribution of topology parameters of water in residue-water interaction network of xylanase

2.4 子網(wǎng)規(guī)模變化趨勢(shì)

在氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中，水的化學(xué)特性決定了其與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)最多能形成兩個(gè)氫鍵，因此將度為2的水看作hub水。相對(duì)于度為1的水，hub水對(duì)蛋白質(zhì)的影響更為重要。在以hub水為中心的聚類過程中，發(fā)現(xiàn)hub水的數(shù)量并沒有影響到聚類后子網(wǎng)的個(gè)數(shù)。無論是嗜熱木聚糖酶還是常溫木聚糖酶的氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)，大部分hub水聚在同一個(gè)子網(wǎng)中，這說明hub水傾向于連接到那些度較高的氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)上，即木聚糖酶的氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)存在“富人俱樂部”現(xiàn)象[25]。圖4是隨著時(shí)間和溫度的變化，子網(wǎng)大小的變化情況。表明了在300 K和375 K時(shí)，耐熱木聚糖酶的子網(wǎng)規(guī)模與常溫木聚糖酶的子網(wǎng)規(guī)模之間差距較為明顯。而在325 K和350 K時(shí)，子網(wǎng)規(guī)模相似。但是總體來說子網(wǎng)大小是隨著溫度升高而減小的。同時(shí)，耐熱木聚糖酶在300 K和325 K時(shí)子網(wǎng)減小的幅度要比常溫木聚糖酶小的多。

圖4 聚類后子網(wǎng)規(guī)模隨著模擬時(shí)間和溫度的變化趨勢(shì)Fig.4 Change trend of sub-network scale with simulation time and temperature after modularized network

2.5 水在子網(wǎng)中所占比例的變化趨勢(shì)

在圖5中，水在子網(wǎng)中的比例也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，隨著溫度升高，水在網(wǎng)絡(luò)中占得比例減小。但是在同一溫度下，耐熱木聚糖酶中水的比例比常溫木聚糖酶要高很多。雖然木聚糖酶中的hub水都能連接到度較大的氨基酸殘基節(jié)點(diǎn)，但是在300、350、375 K情況下，通過圖4可以發(fā)現(xiàn)，常溫木聚糖酶中的子網(wǎng)規(guī)模要比嗜熱木聚糖酶中的子網(wǎng)更大一些，但是水在網(wǎng)絡(luò)中的比例卻小很多。隨著溫度升高，氨基酸殘基與氨基酸殘基之間的作用力會(huì)減弱，部分氫鍵會(huì)斷開，耐熱木聚糖酶可以與水形成更多的作用力來補(bǔ)償，幫助穩(wěn)定整個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[17-18]，但對(duì)于常溫木聚糖酶卻不能表現(xiàn)出同樣的行為?？梢?，水與氨基酸殘基之間的作用力對(duì)維持蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性有很大的作用[14]。

圖5 子網(wǎng)中水所占比例隨著模擬時(shí)間和溫度的變化趨勢(shì)Fig.5 Change trend of proportion of water in the subnetwork with simulation time and temperature

3 結(jié)語

分析了氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)中水的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)水對(duì)木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響與網(wǎng)絡(luò)參數(shù)之間有正相關(guān)關(guān)系。還發(fā)現(xiàn)水與氨基酸殘基的作用會(huì)影響木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。用氨基酸殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)表示蛋白質(zhì)與水的結(jié)構(gòu)，并用一些復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論來研究水與氨基酸殘基之間的作用，以及水如何影響殘基-殘基的相互作用，可以為研究其他類型的蛋白質(zhì)的耐熱性提供一個(gè)有效的思路。