馮詩(shī)倪， 張慧杰， 高曉冬， 中西秀樹(shù)*

（1．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2．江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的生命健康?；熕幬镆蚱溥m用于所有腫瘤類型，是目前應(yīng)用最為廣泛的腫瘤治療方法之一。然而，化療藥物缺乏靶向性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)無(wú)選擇性的殺傷正常組織細(xì)胞；且藥物在機(jī)體內(nèi)代謝較快，容易被腎臟清除，無(wú)法達(dá)到良好的治療效果[1]。為改善化療藥物的治療效果，近年來(lái)藥物載體遞送系統(tǒng)（Drug delivery system，DDS）的發(fā)展提供了一種全新的化療藥物遞送方式。DDS可利用腫瘤部位高通透性和滯留（EPR）效應(yīng)促進(jìn)化療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤部位藥物濃度，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤治療效果[2]。

隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，具有多種功能的納米材料被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]。氮化硼（Boron nitride，BN）納米材料憑借其優(yōu)異的抗氧化性、化學(xué)穩(wěn)定性、潤(rùn)滑性能、以及較高的導(dǎo)熱性成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一，并被廣泛用作復(fù)合物材料、光學(xué)與電子材料等[4]。BN具有與碳納米材料相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，它可看成是B原子與N原子交替連接代替C原子的位置而得[5]。研究表明，BN具有比碳納米材料更優(yōu)異的生物相容性，是一種在醫(yī)學(xué)上極具潛力的納米材料[6]。BNNS作為一種新型BN納米材料，具有均一的球形結(jié)構(gòu)和較低的結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)毒性。2011年，Zhi等[7]首先報(bào)導(dǎo)了BNNS具有良好的生物相容性，并且較易被細(xì)胞攝取。Zhang等[8]曾利用BNNS作為納米載體遞送具有免疫刺激活性的含有CpG基序的寡脫氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BNNS可以保護(hù)CpG ODN在血清中不被酶解，促進(jìn)其被免疫細(xì)胞攝取。BNNS能顯著提高CpG ODN的免疫刺激活性，并刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量抗腫瘤細(xì)胞因子。此外，研究發(fā)現(xiàn)BN可以遞送高濃度硼原子到腫瘤組織中，大大高于血液和其它組織中硼原子含量，使其在硼中子俘獲治療 （Boron neutron capture therapy，BNCT）的應(yīng)用中極具潛力[9-10]。 BN納米材料作為藥物載體或可實(shí)現(xiàn)化療與BNCT療法相結(jié)合的腫瘤協(xié)同治療。這將有可能為抗腫瘤治療提供一種安全高效的新策略。正因如此，BNNS在作為抗癌藥物載體方面顯示了一定的優(yōu)越性。然而，迄今為止基于BNNS的抗腫瘤藥物載體鮮有報(bào)導(dǎo)，BNNS在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用仍待探索和發(fā)掘。此外，BNNS的表面疏水性能使其難以充分分散在有機(jī)溶劑和水中，易產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象，極大地限制了其發(fā)展與應(yīng)用[11]。因此，必須對(duì)BN納米材料進(jìn)行表面功能化修飾。

近年來(lái)，受到自然界生物近乎完美的結(jié)構(gòu)、功能啟示，仿生技術(shù)引起了研究人員的廣泛關(guān)注[12]。通過(guò)對(duì)機(jī)體內(nèi)源性功能成分的模仿，仿生藥物載體能夠與機(jī)體實(shí)現(xiàn)完美兼容，更加高效地進(jìn)行藥物遞送。紅細(xì)胞是脊椎動(dòng)物血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，負(fù)責(zé)向機(jī)體各個(gè)組織細(xì)胞輸送氧氣并回收二氧化碳等代謝產(chǎn)物。在血液循環(huán)系統(tǒng)中，紅細(xì)胞壽命長(zhǎng)達(dá)120 d。紅細(xì)胞優(yōu)異的系統(tǒng)循環(huán)能力得益于其獨(dú)特的形變能力和細(xì)胞膜表面的免疫抑制相關(guān)蛋白[13]。Zhang[14]課題組利用低滲處理制得天然紅細(xì)胞膜，并對(duì)金納米顆粒進(jìn)行包被。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅細(xì)胞膜的包被能幫助金納米顆粒在血液中維持良好的穩(wěn)定性，抑制巨噬細(xì)胞的吞噬。Rao等人[15]利用微流控電穿孔技術(shù)將紅細(xì)胞膜鍍層于磁性納米粒子外，制備出具有核-殼結(jié)構(gòu)的仿生磁性納米粒子RBC-MNs。基于納米粒子優(yōu)良的磁性、光熱性能和紅細(xì)胞膜的血液長(zhǎng)循環(huán)特點(diǎn)，RBC-MNs被用于腫瘤增強(qiáng)核磁共振成像和光熱療法。結(jié)果表明RBCMNs能夠有效逃逸免疫細(xì)胞的吞噬，通過(guò)EPR效應(yīng)大量聚集于腫瘤組織中，顯示出良好的抗腫瘤效果。

作者擬借助紅細(xì)胞膜良好的流動(dòng)性，通過(guò)物理擠壓的方式將其包覆于BNNS外表面，同時(shí)，將疏水性小分子化療藥物DOX嵌插于紅細(xì)胞膜磷脂雙分子層內(nèi)，構(gòu)建出紅細(xì)胞膜包被的，裝載DOX的仿生藥物遞送系統(tǒng)DOX@RBC-BNNS，并對(duì)該遞送系統(tǒng)進(jìn)行表征和體外抗腫瘤效果驗(yàn)證（圖1）。

圖1 DOX@RBC-BNNS的制備過(guò)程Fig.1 Schematic illustration of the preparation process of DOX@RBC-BNNS

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DOX：上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；昆明小鼠（雌性，均6-8周齡）：維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞株：中科院細(xì)胞庫(kù)提供；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清蛋白（FBS）： 美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；Cell-Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒：日本Donjindo公司產(chǎn)品；Alexa Fluor?488-鬼筆環(huán)肽及DAPI：Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅細(xì)胞小體的制備利用眼球取血法取昆明小鼠全血約2 mL置于5 mL離心管中 （內(nèi)含0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.8%檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑）。將上述血液于4℃下3 000 r/min離心20 min，吸除上層血液絨毛層。再將紅細(xì)胞置于預(yù)冷的等滲磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中重懸，后于4℃下離心洗滌3次。將洗凈后的紅細(xì)胞置于預(yù)冷的0.2×PBS低滲緩沖液中重懸，隨后置于4℃冰箱中放置1 h，使之在低滲緩沖液中完全溶血。然后于4℃，9 000 r/min條件下離心15 min，使紅細(xì)胞膜沉淀，去除血紅蛋白。重復(fù)離心洗滌3次，經(jīng)額定功率為60 W的水浴超聲20 min后，制得紅細(xì)胞小體。

1.2.2 RBC-BNNS的構(gòu)建BNNS采用化學(xué)氣相沉積法（CVD）制備而成[16]。將制得的紅細(xì)胞小體和BNNS按質(zhì)量濃度比為1∶1共混，使用迷你擠壓器（Avanti）進(jìn)行往復(fù)的擠壓過(guò)篩，依次使用孔徑為400 nm及200 nm的 Millipore聚碳酸脂膜，連續(xù)過(guò)膜擠壓20次，制得紅細(xì)胞膜包被的RBC-BNNS。

1.2.3 RBC-BNNS的表征RBC-BNNS的形態(tài)表征由JEM-2100透射電子顯微鏡（JEOL，Japan）在加速電壓為80 kV時(shí)得到。表面電位及水合粒徑由Nano ZS Zetasizer（Malvern，England） 測(cè)得。紫外-可見(jiàn)光吸收光譜由Nanodrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific） 測(cè)得。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM（含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%加熱滅活后的FBS及1%鏈霉素/青霉素雙抗）中。置于37℃，環(huán)境濕潤(rùn)的體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)大于80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.5 RBC-BNNS的生物安全性考察利用CCK-8法來(lái)檢測(cè)HeLa細(xì)胞的活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，稀釋成1×l05個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。隨后向培養(yǎng)板中加入系列質(zhì)量濃度的BNNS和RBCBNNS，將96孔板放在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育約3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 DOX的裝載首先以PBS作為緩沖液分別制備1 mg/mL的BNNS和RBC-BNNS溶液，分別取1 mL于離心管中，再向其中加入500 μL DOX溶液（1 mg/mL）。 制備DOX@BNNS時(shí)：將BNNS與 DOX的混合液在避光條件下室溫震蕩24 h。隨后，經(jīng)13 500 r/min離心20 min收集樣品并用PBS洗滌數(shù)次，離心收集得到DOX@BNNS；制備DOX@RBCBNNS時(shí)：將RBC-BNNS與DOX的混合液在避光條件下通過(guò)孔徑為200 nm的迷你擠壓器連續(xù)過(guò)膜擠壓，隨后，經(jīng)13 500 r/min離心20 min后收集樣品并用PBS洗滌數(shù)次，得到DOX@RBC-BNNS。利用Nanodrop檢測(cè)上清中游離DOX的量，通過(guò)計(jì)算得到載體上DOX的裝載量。

1.2.7 DOX@RBC-BNNS的細(xì)胞攝取將HeLa細(xì)胞接種于35 mm的Petri培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后向培養(yǎng)液中加入2.5 μg/mL的DOX@RBC-BNNS，37℃下分別孵育0.5 h、2 h及4 h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞，加入體積分?jǐn)?shù)3.7%甲醛固定30 min。用PBS洗滌細(xì)胞2次后，細(xì)胞膜和細(xì)胞核分別用Alexa Fluor?488鬼筆環(huán)肽和DAPI染色，再用PBS洗滌2次，最后用激光共聚焦顯微鏡分別在405 nm和488 nm通道觀察HeLa細(xì)胞對(duì)DOX@RBC-BNNS的攝取情況并采集相應(yīng)的熒光圖像。

1.2.8 DOX@RBC-BNNS體外抗腫瘤效果評(píng)價(jià)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，100 μL/孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別加入終質(zhì)量濃度為 2 μg/mL的游離 DOX、DOX@BNNS及DOX@RBC-BNNS，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。實(shí)驗(yàn)終止前，各孔分別加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析選用Student檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。數(shù)據(jù)的表達(dá)方式均為平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯著性差異分別被標(biāo)注為*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 RBC-BNNS的構(gòu)建與表征

通過(guò)CVD法制備得到的BNNS具有均一的球形結(jié)構(gòu)，通過(guò)透射電鏡（圖2）可以清晰的觀察到該納米球呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，平均粒徑約為100 nm。經(jīng)RBC包被后，BNNS表面的晶體結(jié)構(gòu)消失，邊緣可見(jiàn)半透明的膜結(jié)構(gòu)，且RBC-BNNS在透射電鏡下呈現(xiàn)出良好的單分散狀態(tài)，粒徑增加為約130 nm。該結(jié)果證明RBC膜成功包被于BNNS表面。

圖2 BNNS和RBC-BNNS的透射電鏡圖片F(xiàn)ig.2TEM images of BNNS and RBC-BMMS

隨后，利用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀對(duì)RBC-BNNS的粒徑、Zeta電位及穩(wěn)定性進(jìn)行考察。圖3顯示，BNNS的水合粒徑為763 nm，這是由于BNNS在水溶液中的團(tuán)聚所造成。通過(guò)低滲處理制得的紅細(xì)胞小體的水合粒徑為227 nm，將其包被于BNNS表面后，RBC-BNNS的粒徑降為150 nm，說(shuō)明RBC-BNNS在溶液中呈單分散狀態(tài)。細(xì)胞膜磷脂雙分子層外部親水，使RBC-BNNS表面具備親水性，在溶液中表現(xiàn)出良好的分散性。Zeta電位結(jié)果顯示，BNNS表面電位約為-32.2 mV，而RBC-BNNS的電位約為-10.6 mV，與紅細(xì)胞小體的表面電位 （-9.5 mV）相似。以上結(jié)果表明，RBC膜的包被改善了BNNS的表面疏水性，極大提升了BNNS的溶液分散性。此外，Zeta電位的變化間接證明了RBC-BNNS的成功制備。

圖4顯示了RBC-BNNS在PBS緩沖液中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果表明RBC-BNNS的粒徑在14 d內(nèi)無(wú)顯著變化，說(shuō)明該仿生納米載體具有良好的分散性和穩(wěn)定性。這種理想的分散穩(wěn)定性增加了RBCBNNS的靜脈給藥可操作性，同時(shí)也將有助于維持藥物在系統(tǒng)循環(huán)過(guò)程中的穩(wěn)定性，避免血管堵塞等不良反應(yīng)的發(fā)生。

圖3 BNNS，RBC小體和RBC-BNNS的粒徑及表面電位Fig.3 Hydrodynamic size and surface zeta potential of BNNS，RBC-Vesicles and RBC-BNNS

圖4 基于粒徑變化的RBC-BNNS穩(wěn)定性考察Fig.4 Stability of RBC-BNNS in terms of particle size

2.2 RBC-BNNS的生物安全性

理想的藥物載體必須具備優(yōu)異的生物安全性。為此，利用CCK-8法對(duì)BNNS及RBC-BNNS的生物安全性進(jìn)行了考察。圖5為不同質(zhì)量濃度的BNNS和RBC-BNNS對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明BNNS和RBC-BNNS在最高質(zhì)量濃度100 μg/mL范圍內(nèi)未表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活性均保持在90%以上，展現(xiàn)出良好的生物相容性。

圖5 BNNS和RBC-BNNS的細(xì)胞毒性檢測(cè)Fig.5 Cytotoxicity of BNNS and RBC-BNNS

2.3 DOX@RBC-BNNS的細(xì)胞攝取

BN納米材料與石墨具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可與疏水性小分子藥物DOX通過(guò)π鍵相互結(jié)合。而RBC-BNNS則通過(guò)其外層RBC膜的疏水性磷脂雙分子層貯存DOX。DOX在RBC-BNNS上的裝載量為214.3 μg/mg，遠(yuǎn)高于其在BNNS上的裝載量（6.7 μg/mg）（圖 6），這是由于 RBC-BNNS 增強(qiáng)的溶液分散性提升了載體的比表面積，且藥物裝載過(guò)程中的機(jī)械擠壓力促進(jìn)了藥物在RBC-BNNS上的裝載。

圖6 BNNS和RBC-BNNS的DOX裝載量Fig.6 DOX loading capacity of BNNS and RBC-BNNS

選擇HeLa細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)DOX@RBC-BNNS的細(xì)胞攝取情況。DOX在488 nm激發(fā)光激發(fā)下能產(chǎn)生紅色熒光，可通過(guò)CLSM考察細(xì)胞對(duì)藥物載體的攝入。CLSM成像結(jié)果如圖7所示，在0.5 h時(shí)，僅有少量DOX@RBC-BNNS進(jìn)入HeLa細(xì)胞；隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)至2 h，大量紅色熒光定位于細(xì)胞質(zhì)中；共孵育4 h后，HeLa細(xì)胞在細(xì)胞核區(qū)域顯示出明亮的紅色熒光。該結(jié)果證明DOX@RBC-BNNS能夠被HeLa細(xì)胞快速高效攝取，隨后DOX能夠從載體上有效釋放并進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。

圖7 HeLa細(xì)胞與DOX@RBC-BNNS共培養(yǎng)0.5 h，2 h及4 h后的共聚焦顯微鏡圖片F(xiàn)ig.7 CLSM images of HeLa cells after incubation with DOX@RBC-BNNS for 0.5 h，2 h and 4 h，respectively

2.4 DOX@RBC-BNNS的體外抗腫瘤效果

最后，利用CCK-8法驗(yàn)證 DOX@RBC-BNNS對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。如圖8所示，游離DOX與載藥納米粒子均表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，但游離DOX及DOX@BNNS對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力相對(duì)較弱。這是由于DOX通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散途徑進(jìn)入細(xì)胞且易被泵出；而DOX@BNNS較差的溶液分散性限制了細(xì)胞對(duì)藥物的攝入[17]。DOX@RBC-BNNS對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果最為明顯，或與其優(yōu)越的分散性和高效的細(xì)胞攝取有關(guān)。以上結(jié)果表明，RBCBNNS在癌癥治療中有很強(qiáng)的藥物運(yùn)載和運(yùn)輸潛力，可被用作有效的藥物載體進(jìn)行深入研究。

圖8 HeLa細(xì)胞與游離 DOX，DOX@BNNS及 DOX@RBC-BNNS共培養(yǎng)48 h后的相對(duì)細(xì)胞活性Fig.8 Relative viability of HeLa cells incubated with free DOX，DOX@BNNS and DOX@RBC-BNNS for 48 hours

3 結(jié) 語(yǔ)

采用低滲處理分離純化紅細(xì)胞膜，通過(guò)機(jī)械擠壓將其包被于BNNS外，制備了一種新型仿生藥物運(yùn)輸載體RBC-BNNS。該載體具有均一的粒徑及良好的分散性，在PBS中能保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。體外毒性實(shí)驗(yàn)表明該載體具有優(yōu)越的生物相容性。該載體的 DOX的裝載量為 214.3 μg/mg，遠(yuǎn)高于BNNS。RBC-BNNS能夠有效輸送DOX進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并在胞內(nèi)進(jìn)行藥物釋放。此外，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了DOX@RBC-BNNS比游離DOX具有更顯著的癌細(xì)胞殺傷效果。綜上，該仿生藥物載體在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用前景，為開(kāi)發(fā)安全高效的藥物載體提供了新思路。