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        內(nèi)鏡黏膜下剝離術在結直腸側向發(fā)育型腫瘤患者中的 治療效果及對Wnt和整合素信號通路的影響*

        2019-10-30 05:42:30陳健張肖麗張月曉李萍齊月雯付欣姿劉璐李炳慶
        中國內(nèi)鏡雜志 2019年9期

        陳健,張肖麗,張月曉,李萍,齊月雯,付欣姿,劉璐,李炳慶

        (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,河北 承德 067000)

        結直腸側向發(fā)育型腫瘤(latelly spreading tumor,LST)是在患者機體內(nèi)生長、腫瘤直徑超過1.0 cm 的病變,其與普通腫瘤的區(qū)別在于病灶腫瘤生長方式的不同。普通腫瘤病灶的生長方式為垂直生長,而結直腸LST 的生長方式是通過側面擴大發(fā)展,屬于扁平型結直腸腫瘤病變疾病,會嚴重影響患者的生活質(zhì)量水平和生存質(zhì)量[1]。隨著醫(yī)學技術的不斷進步,染色劑放大內(nèi)鏡技術已得到了普遍的運用,不僅可以提高結直腸LST 臨床的診斷率,還可以通過手術治療改善患者的病情,具有重要的應用價值[2]。傳統(tǒng)的內(nèi)鏡切除術可以達到一定的臨床效果,其不適用于病灶超過2 cm 的患者,所以切除病灶的完整率較低,會影響患者的治療效果。內(nèi)鏡黏膜下剝離術(endoscopic submucosal dissection,ESD)則可以有效解決切除不完整的問題,且可以影響Wnt 及整合素信號通路,有助于抑制腫瘤的進一步發(fā)展和轉移[3]。本研究對ESD在結直腸LST 患者中的治療效果及對Wnt 及整合素信號通路的影響進行了研究,旨在證實ESD 良好的臨床效果?,F(xiàn)報道如下:

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2016年1月-2018年6月本院收治的70例結直腸LST 患者,隨機分為兩組,每組患者35例。納入標準:①通過結腸鏡檢出病變直徑2.0 cm 以上;②患者自愿參與本次研究。排除標準:①抬舉征為陰性的患者;②放大內(nèi)鏡觀察結直腸黏膜Pit Pattern分型為不規(guī)則形態(tài);③患者不同意參與本次研究。研究組中,男20例,女15例,年齡38~66 歲,平均(45.3±1.3)歲;對照組中,男22例,女13例,年齡37~65 歲,平均(44.6±1.5)歲。兩組患者的一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準且患者均知情同意。

        1.2 方法

        手術前對所有患者進行心電圖、血常規(guī)、凝血功能、生化、心臟超聲和胸片等常規(guī)術前檢查,必要時給予糾正,給予患者丁溴東莨菪堿緩解腸道痙攣,全憑靜脈麻醉下手術。

        1.2.1 研究組 對研究組患者進行ESD 治療。給予靛胭脂染色后,確定病變區(qū)域的環(huán)境來確定患者的病變情況。取靛胭脂腎上腺素氯化鈉注射液,注射在患者病變的基底以及病變周圍的黏膜區(qū),必要時注射液中按比例加入玻璃酸鈉注射液。在病變位置的外側大約0.5 cm 處用Dual 刀切開環(huán)形黏膜,接著進行剝離操作,一直到整個病變區(qū)域黏膜完全剝離為止。在進行黏膜剝離時要注意患者術中出血的風險,提前準備好電凝鉗進行止血[4]。手術后對創(chuàng)面運用電凝鉗進行徹底止血,有需要時運用鈦夾行止血或封閉創(chuàng)面,將剝離完成后的標本完全展開,使用昆蟲針將其固定在標本板上,浸泡在甲醛溶液中送到病理科進行組織病理檢查[5-6]。手術結束后,醫(yī)師要叮囑患者在術后禁止飲食至少48 h,同時給予患者補液,必要時給予抗生素預防感染等處理,依據(jù)患者術后的腹痛和便血等情況來判斷患者的恢復狀況,要定期進行隨訪記錄[7]。

        1.2.2 對照組 對照組患者采用分片切除術,在內(nèi)鏡下用靛胭脂染色確定病變范圍;于病變基底黏膜下注射,使病變充分隆起,在透明帽輔助下,將病灶吸入透明帽,并行內(nèi)鏡下圈套電切、電凝,按照病灶大小分次切除,方法為沿著病灶一側多次切除,直至患者病灶被完全切除[8]。切除后,染色檢查患者創(chuàng)面邊緣有無病灶遺留,若有殘留病灶可予氬氣刀治療,觀察患者創(chuàng)面有無出血、是否平整等。

        1.3 觀察標準

        1.3.1 免疫功能觀察標準 在治療前后抽取患者外周血淋巴細胞,采用機型為EPICSXL 的流式細胞儀對CD4+和CD8+進行測定,并計算CD4+/CD8+的數(shù)值。

        1.3.2 不良反應評定標準 通過隨訪,記錄患者在術后產(chǎn)生的不良反應,不良反應主要有穿孔、消化道出血和復發(fā)等。

        1.3.3 生命質(zhì)量評分標準 生命質(zhì)量評分(quality of life,QOL)標準:觀察患者治療前后食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦和疼痛等方面的情況,食欲、精神、睡眠、疲倦和疼痛的滿分值為5 分,生活能力方面的滿分值為20 分,每一項的分數(shù)越高則證明生活質(zhì)量越差[9]。

        1.4 Wnt/β-catenin 通路分子表達量測定

        應用Western blotting 方法對Wnt 通路進行分析。對Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標應用熒光定量PCR 試劑盒進行測定,數(shù)值越接近正常值,治療效果越好。Western 印跡分析檢測,對培養(yǎng)細胞進行收集,用PBS 清洗,加入細胞裂解液裂解細胞,提取總蛋白,應用Bradford 比色法測定蛋白含量。每個樣品槽內(nèi)45μl 樣本進行SDS-PAGE 電泳,通過電轉印法,將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉移至PVDF 膜,轉印后的PVDF 膜用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,再加入一抗(濃度1 ∶1 000),37℃孵育2 h,TBS 洗膜后加入濃度為1 ∶5 000 的二抗(羊抗兔),37℃孵育2 h,TBS 洗膜,DAB 顯色液顯色,拍照。熒光定量PCR 檢測,首先進行組織培養(yǎng),然后對培養(yǎng)細胞進行收集、染色,抽提總RNA,反轉錄制備cDNA,按照說明書步驟操作。

        1.5 統(tǒng)計學方法

        數(shù)據(jù)應用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析,其中計數(shù)以百分比(%)表示,進行χ2檢驗,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,行t檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 兩組患者免疫功能比較

        術前兩組患者的免疫功能比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),術后研究組患者的免疫功能指標明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

        表1 兩組患者手術前后免疫功能比較 (±s)Table1 Comparison of immune function before and after surgery between the two groups (±s)

        表1 兩組患者手術前后免疫功能比較 (±s)Table1 Comparison of immune function before and after surgery between the two groups (±s)

        注:t 組間值和P 組間值為研究組與對照組治療后比較

        組別 CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組(n =35) 術前 42.3±1.6 14.4±1.2 2.1±0.4 術后 46.5±1.4 18.3±1.3 2.3±0.6 t 值 10.48 12.10 11.94 P 值 0.042 0.046 0.049研究組(n =35) 術前 42.7±1.3 14.7±1.5 2.1±0.5 術后 52.5±1.7 20.5±1.0 2.7±0.8 t 值 12.84 15.01 15.22 P 值 0.039 0.031 0.034 t 組間值 16.84 18.25 18.01 t 組間值 0.011 0.016 0.013

        2.2 兩組患者術后不良反應比較

        兩組患者在術后均未出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥,如穿孔、消化道出血等。

        2.3 兩組患者術后復發(fā)情況比較

        對照組復發(fā)3例,復發(fā)率為8.6%,研究組復發(fā)1例,復發(fā)率為2.9%,研究組復發(fā)率低于對照組,但兩組比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.88,P=0.082)。

        2.4 兩組患者生活質(zhì)量水平比較

        術前兩組患者的生活質(zhì)量水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),術后研究組與對照組患者QOL 評分均明顯低于術前,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且術后研究組患者QOL 評分明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

        2.5 兩組患者病變部位比較

        對照組患者的病變有37 處。其中,橫結腸4 處,直腸10 處,乙狀結腸15 處,降結腸3 處,升結腸5 處。研究組患者的病變有38 處。其中,橫結腸3 處,直腸6 處,乙狀結腸22 處,降結腸5 處,升結腸2 處,兩組患者病變部位比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

        表2 兩組患者QOL 評分情況比較 (分,±s)Table2 Comparison of QOL score between the two groups (score,±s)

        表2 兩組患者QOL 評分情況比較 (分,±s)Table2 Comparison of QOL score between the two groups (score,±s)

        注:t 組間值和P 組間值為研究組與對照組治療后比較

        組別 食欲 精神 睡眠 生活能力 疲倦 疼痛對照組(n =35) 術前 3.1±1.3 4.1±1.4 3.6±1.2 18.2±3.1 3.2±1.1 5.1±1.5 術后 2.3±0.5 3.2±1.2 3.5±1.6 15.2±3.4 2.2±1.5 4.6±1.4 t 值 10.41 11.02 11.84 12.05 12.84 12.65 P 值 0.022 0.026 0.049 0.013 0.021 0.042研究組(n =35) 術前 3.1±1.2 4.1±1.3 3.5±1.8 17.9±4.1 3.2±1.3 5.2±1.3 術后 1.4±0.7 2.3±0.8 2.1±1.1 12.4±4.8 1.5±0.9 3.2±1.2 t 值 15.00 15.61 16.84 15.48 16.02 15.43 P 值 0.033 0.028 0.022 0.041 0.026 0.049 t 組間值 18.94 19.02 18.41 19.42 18.40 19.84 P 組間值 0.032 0.023 0.019 0.041 0.036 0.021

        2.6 兩組患者大體分型比較

        如表4所示,對照組大體分型為顆粒均一型16處,結節(jié)混合型11 處,扁平隆起型8 處,假凹陷型2 處;研究組大體分型為顆粒均一型15 處,結節(jié)混合型11處,扁平隆起型7 處,假凹陷型5 處,兩組患者大體分型比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

        表3 兩組患者病變部位比較例(%)Table3 Comparison of lesion position between the two groups n(%)

        表4 兩組患者大體分型比較例(%)Table4 Comparison of gross classification between the two groups n(%)

        2.7 兩組患者病變直徑比較

        兩組患者的病變直徑比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

        2.8 治療前后兩組患者Wnt/β-catenin 通路分子表達量比較

        治療前,兩組Wnt/β-catenin 通路分子表達量沒有明顯區(qū)別(P>0.05);治療后,研究組Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標均明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

        表5 兩組患者病變直徑比較 (mm,±s)Table5 Comparison of lesion diameter between the two groups (mm,±s)

        表5 兩組患者病變直徑比較 (mm,±s)Table5 Comparison of lesion diameter between the two groups (mm,±s)

        組別 最大直徑 最小直徑 平均直徑對照組(n =35) 40.1±4.0 11.4±2.2 25.8±2.4研究組(n =35) 40.1±4.4 11.3±2.3 26.2±2.6 t 值 1.58 1.85 1.62 P 值 0.091 0.084 0.082

        表6 治療前后兩組患者Wnt/β-catenin 通路分子表達量比較Table6 Comparison of molecular expression of Wnt/β-catenin pathway between the two groups before and after treatment

        3 討論

        結直腸LST 相比普通腫瘤中結直腸黏膜誘發(fā)的隆起性病變,其特異性和特殊性更強,且隨著病情的逐漸發(fā)展,患者病變的形態(tài)會出現(xiàn)顯著差別,臨床稱此特殊病變?yōu)榇竽c腺瘤,屬于特殊腫瘤類型疾病之一[10-11]。據(jù)臨床相關研究[12]報道,結直腸LST的外表相對較平坦,采用傳統(tǒng)的內(nèi)鏡下黏膜切除術(endoscopic mucosal resection,EMR)無法完全切除,但是患者病變直徑如果超過2.0 cm,采用分片切除術進行治療時,患者常會伴有復發(fā)或者腫瘤殘余的情況,不利于患者的生活質(zhì)量及病情的康復。本次研究運用ESD 對結直腸LST 患者進行治療,分析其臨床療效及其對Wnt 和整合素信號通路的影響。

        采用ESD 對結直腸LST 患者進行治療,可以有效減少手術創(chuàng)傷,減輕對機體造成的免疫抑制程度。本研究顯示,術前兩組患者的免疫功能比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),術后研究組患者的免疫功能指標明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這一結果說明,采用ESD 治療可以有效降低患者術后免疫抑制程度,這也是促進患者康復的關鍵。結直腸LST 存在易癌變和不容易向黏膜下浸潤等特點,其中假凹陷型病變發(fā)生黏膜癌變的可能性最大,且在大腸癌的發(fā)生中意義重大,備受臨床內(nèi)鏡醫(yī)師的關注[13]。ESD 是近年發(fā)展起來的新型內(nèi)鏡治療技術,其可以一次性地將整個病變區(qū)域切除,可以有效避免采用分片切除術引起的病灶殘留,且采用ESD 還能提供完整的病理組織資料,可以準確評估病灶的邊緣情況,有助于降低病變的復發(fā)率,是目前臨床上治療結直腸LST 最理想的方法[14-15]。兩組患者在術后均未出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥,如穿孔和消化道出血,研究組患者術后復發(fā)率為2.9%,對照組患者術后復發(fā)率為8.6%,研究組復發(fā)率與對照組無明顯差異(P>0.05)。雖然,本研究中并未出現(xiàn)穿孔病例,但是以往有研究[16]表明,ESD 具有較高的穿孔發(fā)生率,分析其原因可能與腫瘤大小、手術時間及醫(yī)師操作水平等有關。結直腸LST 的癌變率較高,組織中存在較多與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移相關的基因,Wnt 是一種分泌型蛋白,其通過自身分泌和其他細胞分泌來與細胞膜上的受體進行結合,可以將多條細胞的信號通道激活。Wnt 信號通路可以參與到多種細胞的增殖和分化,其通路具有高度的保守性,并且Wnt信號通路在成熟組織中及胚胎生長中發(fā)揮著重要的 作用[17-18]。

        Wnt/β-catenin 通路在結直腸LST 患者病程中具有非常重要作用,是一種有效信號通路,該家族中包括19 個成員,在病情發(fā)展變化中,Wnt1、Wnt5a 和Wnt7b 等均會參與,對病情發(fā)展變化產(chǎn)生嚴重影響。β-catenin 為Wnt 通路中非常重要的樞紐分子,如果Wnt 刺激較少,會與GSK-3β、Axin 和APC 形成復合體,降低了造成細胞質(zhì)游離的β-catenin,抑制信號通路。另外,當細胞內(nèi)進入Wnt1、Wnt5a 和Wnt7b 等分子后,β-catenin 與GSK-3β、Axin 和APC 會出現(xiàn)進一步解離,在子細胞質(zhì)中不斷增多,再在細胞核中轉位,對下游靶基因表達進行進一步轉位。本研究探究ESD 在結直腸LST 患者中對Wnt 信號通路的影響,研究結果顯示,治療前,兩組Wnt/β-catenin 通路分子表達量沒有明顯區(qū)別(P>0.05);治療后,研究組Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標低于對照組(P<0.05),兩組患者與治療前比較,Wnt1、Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 指標均得到明顯改善。本研究表明,對結直腸LST 患者進行ESD 治療,效果理想,可對Wnt/β-catenin 通路的激活進行有效抑制,對治療效果提升具有非常重要的作用。

        使用ESD 對結直腸LST 患者進行治療,在此過程中會抑制Wnt 信號通路的表達,會迅速抑制Wnt 與其他受體復合物結合,使Wnt 的靶基因得不到表達,并且無法進入細胞核內(nèi)達到“啟動狀態(tài)”,而Wnt 蛋白富含半胱氨酸類的糖蛋白,留存于半胱氨酸的恒定保守區(qū)[19]。當Wnt 沒有信號時,無法刺激腫瘤細胞進一步發(fā)展,采用ESD 有助于整合素信號通路[20]。Wnt 信號通路中的β-catenin 以及下游信號通路在直腸癌患者中的表達上升,其作用機制還不明確?;颊逩SK-3β 的磷酸化是誘發(fā)β-catenin 上升的影響因素。磷酸化GSK-3β 屬于GSK-3β 的重要失活形式,磷酸化GSK-3β 表達上升之后,失活GSK-3β增多,降解胞質(zhì)當中β-catenin 的效果也隨之下降,使得β-catenin 表達上升。整合素鏈接激酶(integrin linked kinase,ILK)是β-catenin 的上游調(diào)節(jié)分子,能夠磷酸化GSK-3β,增加β-catenin 表達,在ILK表達上升之后,ILK 可以趁機使GSK-3β 的磷酸化,使得GSK-3β 喪失活性而使β-catenin 表達上升,激活下游通路[20]。ESD 術后,ILK 能夠借助于磷酸化GSK-3β 來刺激β-catenin 表達上調(diào)。

        本研究不足之處,因結直腸LST 發(fā)病率較低,本次研究的樣本數(shù)量較少,持續(xù)時間較短,缺乏客觀性。因此,需要進一步進行多中心、大樣本的研究來提高研究的可靠性。

        綜上所述,ESD 在結直腸LST 患者的治療中具有良好的臨床療效,可提高患者術后的生活質(zhì)量水平和免疫功能,且可以有效抑制Wnt 基因的表達,阻斷Wnt 在腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展及轉移,具有廣泛的應用前景,值得在臨床上進一步推廣和應用。

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