余書(shū)奇，包曉青，梁明在*，金晨鐘，田 蔚

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2.璞勵(lì)卓越（北京）科技有限公司，北京 100000；3.義守大學(xué)化工系，中國(guó)臺(tái)灣 高雄 84001）

靈芝作為傳統(tǒng)的中藥材具有很高的藥用價(jià)值，已經(jīng)成為保健食品的主要原料之一。研究發(fā)現(xiàn)靈芝具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等藥理功能[1]，其中靈芝三萜類(lèi)化合物是靈芝的關(guān)鍵藥效成分之一，主要指標(biāo)成分為靈芝酸A、靈芝酸F和靈芝醇B，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝三萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抗菌消炎等功能[2-6]。因此，對(duì)靈芝中的靈芝三萜類(lèi)化合物進(jìn)行有效提取及純化，可拓寬靈芝產(chǎn)品多元化發(fā)展。目前，靈芝三萜類(lèi)化合物的提取多采用有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助提取等方式。而采用超臨界二氧化碳提取可提高靈芝三萜類(lèi)化合物的穩(wěn)定性，并且綠色無(wú)污染，安全無(wú)毒[7-9]。研究顯示超臨界流體萃取的操作條件對(duì)產(chǎn)物中靈芝三萜類(lèi)化合物的組分種類(lèi)和活性有一定程度的影響[10-13]，因此本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超臨界流體萃取的最佳條件與方法；同時(shí)采用模擬移動(dòng)床（simulated moving bed，SMB）移除粗萃物中的不純物以提高靈芝三萜類(lèi)化合物含量。SMB技術(shù)是一種現(xiàn)代化精細(xì)的色譜分離技術(shù)，在固定床和真實(shí)移動(dòng)床的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)[14-15]。該技術(shù)采用固定相與移動(dòng)相連續(xù)式地逆向流動(dòng)，大幅提高了固定相的使用效率，達(dá)到連續(xù)進(jìn)料提高產(chǎn)量的目的[15-17]。由于其相對(duì)于傳統(tǒng)制備色譜分離技術(shù)具有能連續(xù)化操作、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、分離能力強(qiáng)、分離效率高等特點(diǎn)，因而在食品科學(xué)和生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[18-22]，目前，食品領(lǐng)域中SMB的應(yīng)用熱點(diǎn)在天然產(chǎn)物的提取純化上，如鐵皮石斛[23]、白藜蘆醇[24]、紫杉醇[25]、甜葉菊苷[26]、甘草苷[27]等的純化，曾有研究者利用使用超臨界流體的SMB進(jìn)行了中國(guó)臺(tái)灣牛樟芝三萜的分離純化研究[28]，但國(guó)內(nèi)外尚未有SMB純化靈芝三萜類(lèi)化合物的應(yīng)用報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實(shí)體由浙江壽仙谷公司提供，為赤靈芝。

靈芝酸A（＞98%）、靈芝酸F（＞98%）、靈芝醇B（＞98%）標(biāo)準(zhǔn)品 成都曼思特股份有限公司；95%乙醇景明化工股份有限公司；乙腈（色譜純） 友和貿(mào)易股份有限公司；二氧化碳30 kg（插管、高純度）錦德氣體股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜（ high performance liquid chromatography，HPLC，泵：2130，紫外檢測(cè)器：L-2455）儀 日本Hitachi公司；超臨界萃取設(shè)備（萃取槽體積為1 L，10.5 cm×11.1 cm） 中國(guó)臺(tái)灣金屬工業(yè)研究中心；SMB色譜（1/8不銹鋼配管，配置8 支管柱，1.0 cm×25 cm） 中國(guó)臺(tái)灣喬璞科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超臨界流體萃取條件優(yōu)化

取1 3 7 g的靈芝子實(shí)體切粒（顆粒直徑約1～3 mm），置于萃取槽中，在350 bar、45 ℃進(jìn)行萃取，每0.5 h從分離槽中取樣一次，分離槽溫度設(shè)定為50 ℃，壓力設(shè)定為45 bar，持續(xù)萃取6 h，根據(jù)萃取液中目標(biāo)物含量的變化確定萃取時(shí)間?？疾鞀A帶劑對(duì)萃取結(jié)果的影響：A組不添加夾帶劑，二氧化碳流速為60 g/min，在萃取過(guò)程中同時(shí)從萃取槽出口端以5 mL/min流速泵入乙醇溶液，以避免萃取物阻塞；B組采用乙醇為夾帶劑，流速為5 mL/min，二氧化碳流速為60 g/min，在進(jìn)入萃取槽前便與二氧化碳混合后再加熱，共同進(jìn)入萃取槽中萃取。

1.3.2 萃取液中靈芝三萜類(lèi)化合物含量的測(cè)定

采用1.3.1節(jié)B組的方式對(duì)靈芝進(jìn)行萃取，所得萃取液用HPLC測(cè)定目標(biāo)組分含量。分析方法參照文獻(xiàn)[29]：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相按表1進(jìn)行梯度洗脫，分析波長(zhǎng)252 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。繪制靈芝酸A、靈芝醇B及靈芝酸F標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999 5以上，線性范圍在0～500 mg/L，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法測(cè)定靈芝三萜類(lèi)化合物的含量。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫方法Table 1 Mobile phase gradient elution program

3 種標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC如圖1所示，靈芝酸A的保留時(shí)間為35.1 min，靈芝酸F的保留時(shí)間為53.0 min，靈芝醇B的保留時(shí)間為86.5 min。

圖1 靈芝三萜類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatogram of triterpenoid standards

1.3.3 SMB初始參數(shù)確定

按1.3.1節(jié)B組的方法萃取靈芝，所得萃取液作為SMB的進(jìn)樣原料。選取SMB系統(tǒng)8 只管柱中的1只管柱作為HPLC的分析柱，將C18填料填充于1.0 cm×25 cm的不銹鋼管柱中。采用95%乙醇溶液及0.01%鹽酸溶液作為流動(dòng)相?？疾觳煌鲃?dòng)相配比（乙醇溶液與鹽酸溶液體積比為95∶5、90∶10、85∶15、50∶50、45∶55、40∶60）對(duì)分離結(jié)果的影響，從而選擇適合SMB系統(tǒng)的流動(dòng)相。

1.3.4 SMB參數(shù)優(yōu)化設(shè)計(jì)

以1.3.1節(jié)B組方法所得到的萃取液為進(jìn)樣原料，以C18為固定相，選擇1.3.3節(jié)最佳比例的乙醇-鹽酸溶液作為流動(dòng)相。通過(guò)優(yōu)化SMB操作參數(shù)：不同的管柱設(shè)計(jì)、流動(dòng)相配比及多通閥的切換時(shí)間等分離純化靈芝三萜類(lèi)化合物。分離實(shí)驗(yàn)共分兩組進(jìn)行：第1組目的是將低極性雜質(zhì)分離，第2組目的是將高極性雜質(zhì)分離。

1.3.5 三角形理論

SMB參數(shù)設(shè)計(jì)主要包括各出入口端流速的設(shè)定與多通閥的切換時(shí)間，本研究SMB參數(shù)的設(shè)定以三角形理論為基礎(chǔ)[30-32]，“三角形理論”法是在線性條件或非線性條件下，對(duì)操作SMB快速選擇合適實(shí)驗(yàn)條件的有用工具。它能用于確定最佳條件，并可通過(guò)公式在高產(chǎn)率和短切換時(shí)間上得到一個(gè)折中方案。其主要參數(shù)mj為第j區(qū)段移動(dòng)相的體積流速與固體體積流速的比值，定義如下：

式中：Qj為j區(qū)段流體的體積流速；VC為空管柱體積（本研究所采用的管柱體積為11.78 mL）；tsw為所設(shè)定的多通閥切換時(shí)間周期；εt為管柱的孔隙度，即柱橫截面上流動(dòng)相所占的分?jǐn)?shù)，為管柱內(nèi)流動(dòng)相體積與柱總體積之比；Vd為死體積，即管柱中未被固定相占據(jù)的空隙體積。

本研究進(jìn)一步假設(shè)εt＝0.35，并忽略死角體積Vd＝0。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

SMB結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法：SMB系統(tǒng)平衡穩(wěn)定后，收取一個(gè)循環(huán)周期每個(gè)端口的樣品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑后，定容，通過(guò)液相色譜定量分析目標(biāo)組分的濃度。

三角形繪制方法：通過(guò)式（2）[33-34]計(jì)算SMB中各組分的亨利常數(shù)K，假設(shè)實(shí)驗(yàn)中共有兩個(gè)組分A和B，其中A組分為弱滯留性成分，B組分為強(qiáng)滯留性成分，所對(duì)應(yīng)的亨利常數(shù)分別為KA和KB，將兩個(gè)K值標(biāo)注于正方形平面的對(duì)角線上，那么平行于縱坐標(biāo)且通過(guò)KA的直線與平行于橫坐標(biāo)且通過(guò)KB的直線將構(gòu)成一個(gè)三角形區(qū)域，該三角形區(qū)域即為理論上可以分離A和B兩組分的操作區(qū)間。依據(jù)式（1）及管柱設(shè)計(jì)形態(tài)分別求得第2段區(qū)段和第3段區(qū)段的m值，即分別為m2與m3值，然后以m2為橫坐標(biāo)，m3為縱坐標(biāo)將每組操作條件標(biāo)在平面上。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則可推算出實(shí)際可分離A和B兩組分的操作區(qū)間，以下將以虛線三角形表示。

式中：t為SMB單柱實(shí)驗(yàn)中組分的保留時(shí)間；t0為接管柱后系統(tǒng)的死時(shí)間；td為不接管柱時(shí)系統(tǒng)的死時(shí)間；εt為管柱的孔隙度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界萃取條件優(yōu)化結(jié)果

如圖2所示，A組僅在萃取的前0.5 h可以得到訊號(hào)較強(qiáng)的萃取物，但峰響應(yīng)低，目標(biāo)物含量低，因此單獨(dú)使用超臨界二氧化碳無(wú)法有效地萃取靈芝子實(shí)體中的三萜類(lèi)化合物。對(duì)比圖2中A、B組可發(fā)現(xiàn)，兩者的HPLC圖譜的信號(hào)數(shù)量與峰形極其相似，說(shuō)明此兩種萃取方式所得到的產(chǎn)物基本一致。B組中各組分的響應(yīng)值明顯高于A組，表明添加乙醇作為夾帶劑更能有效地萃取出靈芝三萜類(lèi)化合物。這可能是因?yàn)殪`芝三萜類(lèi)化合物的極性偏高，更易溶于添加乙醇溶液的超臨界二氧化碳中。因此，后續(xù)SMB實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)料選擇B組方式進(jìn)行萃取。

圖2 A組（不添加夾帶劑）和B組（添加乙醇為夾帶劑）萃取液的液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatograms of extracts A (without co-solvent) and B(with co-solvent)

2.2 粗萃物中靈芝三萜類(lèi)化合物含量分析

由圖2B可看出，萃取2 h后大部分物質(zhì)已基本萃取完全。取萃取前3 h中每0.5 h所收集的萃取液進(jìn)行定量濃縮，干燥后可得到每0.5 h粗萃物的量，再根據(jù)目標(biāo)物的濃度可算出每0.5 h粗萃物中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如表2所示。計(jì)算結(jié)果表明2-4之后的樣品中靈芝酸A、靈芝酸F及靈芝醇B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0或極少，即萃取2 h后目標(biāo)組分已萃取完全，這與圖2B結(jié)果一致。將前2 h收集到的萃取液混合，揮干溶劑共收集得到1.30 g，代表每千克子實(shí)體可以萃取到9.49 g的粗萃物。同時(shí)依據(jù)表2所得質(zhì)量濃度，可計(jì)算得出3 種目標(biāo)成分在粗萃物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：靈芝酸A為4.50%，靈芝酸F為3.39%，靈芝醇B為0.29%。

表2 超臨界二氧化碳混合乙醇萃取靈芝三萜類(lèi)化合物含量Table 2 Contents of triterpenoids extracted by supercritical CO2 extraction using ethanol as co-solvent

2.3 SMB初始參數(shù)確定

單柱實(shí)驗(yàn)中，不同流動(dòng)相配比（95%乙醇溶液與0.01%鹽酸溶液體積比為95∶5、90∶10、85∶15、50∶50、45∶55、40∶60）的分離色譜圖如圖3所示。通過(guò)色譜圖可見(jiàn)，乙醇溶液比例高于85%時(shí)，可有效地將樣品中的所有物質(zhì)脫附下來(lái)，但是當(dāng)乙醇溶液比例低于50%時(shí)，便無(wú)法將全部樣品脫附。因此若使用低比例乙醇溶液的流動(dòng)相，在組態(tài)設(shè)計(jì)上需要加入潤(rùn)洗的操作，且潤(rùn)洗操作時(shí)的流動(dòng)相需提高乙醇溶液的比例，才能使固定相成功再生。依據(jù)這些單柱層析圖譜結(jié)果，本研究設(shè)計(jì)出2 組SMB分離實(shí)驗(yàn)，通過(guò)去除粗萃液中高極性和低極性雜質(zhì)，達(dá)到純化靈芝三萜類(lèi)化合物的目的。其中，第1組SMB的實(shí)驗(yàn)以加入0.01%鹽酸的乙醇溶液作為流動(dòng)相，第2組SMB的分離則以體積比例為40∶60的乙醇溶液與鹽酸（0.01%）混合溶液作為流動(dòng)相。

圖3 不同流動(dòng)相的單柱分離色譜圖Fig. 3 Chromatograms for single column separation with different mobile phases

2.4 第1組SMB分離實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

傳統(tǒng)的SMB共有4 個(gè)區(qū)段組成，其中第4區(qū)段主要是利用固體吸附劑將殘留在移動(dòng)相中的弱滯留性物質(zhì)成分清除干凈，避免被移動(dòng)相帶出床體之外繼續(xù)循環(huán)而導(dǎo)致污染。由于本實(shí)驗(yàn)中靈芝粗萃液中的成分種類(lèi)多而復(fù)雜，因此在組態(tài)設(shè)計(jì)上選擇開(kāi)放式系統(tǒng)，并且刪除第4區(qū)段，以不回流移動(dòng)相的方式解決弱滯留成分可能循環(huán)累積在系統(tǒng)的問(wèn)題，如圖4所示。設(shè)定SMB組態(tài)為2/3/3，其中共有2 個(gè)入口，即進(jìn)料端（F端）、移動(dòng)相端（D端），以及2 個(gè)出料口，即萃出液端（E端）、萃余液端（R端）。設(shè)定各進(jìn)出口端的流速為D端5 mL/min，F(xiàn)端0.5 mL/min，E端2.083 mL/min，R端3.417 mL/min。

圖4 第1組SMB實(shí)驗(yàn)的管柱組態(tài)設(shè)計(jì)Fig. 4 SMB column configuration design for experimental group 1

當(dāng)系統(tǒng)達(dá)穩(wěn)態(tài)操作后，在2個(gè)出口端收集樣品并分析。在固定流速的情況下，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了不同切換時(shí)間的測(cè)試，由表3可知，在切換時(shí)間為3.4 min時(shí)移除強(qiáng)滯留性的雜質(zhì)效果最佳。且在該條件下，3 種目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相應(yīng)提高，靈芝酸A提高至5.70%，靈芝酸F提高至4.17%，靈芝醇B提高至0.85%。由于所增加的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有限，推測(cè)是因?yàn)榈蜆O性雜質(zhì)的含量不多，所以指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加有限。

表3 不同切換時(shí)間的SMB分離結(jié)果（第1組）Table 3 Results of SMB separation at different switching times in experimental group 1

依據(jù)式（1）分別求得m2與m3值，然后以m2為橫坐標(biāo)，m3為縱坐標(biāo)繪圖所構(gòu)成的平面圖稱(chēng)其為（m2，m3）平面。如果將SMB實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的操作條件分別標(biāo)示在（m2，m3）平面上，如圖5所示，圖中實(shí)線構(gòu)成的直角三角形代表三角形理論計(jì)算能夠分離低極性雜質(zhì)的操作區(qū)間，其中三萜類(lèi)化合物與雜質(zhì)的等溫吸附常數(shù)分別為0.743與1.107。依據(jù)表3可見(jiàn)，在切換時(shí)間周期大約為3.3～3.5 min之間，可以有效移除弱滯留性成分，并依循Yu Hongwei等[33]提出建立最佳操作條件的方法，本研究繪制出圖5虛線所構(gòu)成的三角形。該虛線構(gòu)成的三角形頂點(diǎn)坐標(biāo)為（0.759，1.014），如果在此操作條件下進(jìn)行，假設(shè)切換時(shí)間設(shè)為1.0 min，那么其各出入口端的流量設(shè)定分別為D端12.6 mL/min，F(xiàn)端1.677 mL/min，E端2.389 mL/min，R端11.888 mL/min。若按照最佳條件的流速設(shè)定SMB各進(jìn)出口的流速，以同樣的進(jìn)料質(zhì)量濃度3 937 mg/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，那么可預(yù)測(cè)此SMB設(shè)備平均每天每升填料的處理量，即本SMB系統(tǒng)在移除低極性雜質(zhì)時(shí)固定相的效率為0.061 kg/（L·d）。

圖5 第1組SMB分離實(shí)驗(yàn)三角形理論預(yù)測(cè)Fig. 5 Triangle theory prediction of SMB separation in experimental group 1

2.5 第2組SMB分離實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

用1.3.1節(jié)B組方法所得到的萃取液進(jìn)行濃縮，并取濃縮溶液400 mL，再加入600 mL的0.01%鹽酸，過(guò)濾后得第2次進(jìn)料溶液。如圖6所示，本組SMB分離實(shí)驗(yàn)設(shè)定SMB組態(tài)為1-1-3/3，其中共有4 個(gè)入口，即進(jìn)料端（F端）、移動(dòng)相端（D端）、清洗端（Wash端）、潤(rùn)洗端入口（Rinse1端）以及3 個(gè)出料口，即萃余液端（R端），清洗端出口（W端），潤(rùn)洗端出口（Rinse 2端）。移動(dòng)相使用乙醇-鹽酸體積比40∶60，清洗端則使用添加0.01%鹽酸的乙醇溶液，并設(shè)定各進(jìn)出口端的流速為D端3.8 mL/min，F(xiàn)端0.3 mL/min，R端4.1 mL/min，Wash端5 mL/min，Rinse1端5 mL/min。

圖6 第2組SMB實(shí)驗(yàn)的管柱組態(tài)設(shè)計(jì)Fig. 6 SMB column configuration design for experimental group 2

根據(jù)表4可知，在切換時(shí)間為34 min時(shí)，R出口端目標(biāo)組分未有響應(yīng)，但根據(jù)干質(zhì)量結(jié)果可知R出口端分離出大量物質(zhì)，但在本分析方法的檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)法測(cè)出。同時(shí)根據(jù)Wash端的含量計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度提高，其中靈芝酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.34%，靈芝酸F質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.51%，靈芝醇B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.74%。這代表大部分的三萜類(lèi)化合物成分是高極性雜質(zhì)，少部分為第1組SMB所分離出的低極性雜質(zhì)。因此針對(duì)超臨界流體萃取所得的粗萃物，提高三萜類(lèi)化合物含量的重點(diǎn)在移除高極性的雜質(zhì)。

表4 不同切換時(shí)間的SMB分離結(jié)果（第2組）Table 4 Results of SMB separation at different switching times in experimental group 2

同樣如果將第2組SMB分離實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的操作條件分別標(biāo)示在（m2，m3）平面上，如圖7所示。根據(jù)表4結(jié)果可判定分離的切換時(shí)間周期在34～35 min之間，據(jù)此繪出圖中虛線構(gòu)成的三角形，并計(jì)算出其頂點(diǎn)坐標(biāo)為（6.133，7.662）。如果在此操作條件下進(jìn)行，假設(shè)切換時(shí)間設(shè)定為1.0 min，那么其各出入口端的流量設(shè)定分別為D端64.8 mL/min，F(xiàn)端11.709 mL/min，E端13.712 mL/min，R端62.796 mL/min，并以進(jìn)料濃度3 937 mg/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)此本SMB系統(tǒng)在移除高極性雜質(zhì)時(shí)固定相的效率為0.423 kg/（L·d）。

圖7 第2組SMB分離實(shí)驗(yàn)三角形理論預(yù)測(cè)Fig. 7 Triangle theory prediction of SMB separation in experimental group 2

3 結(jié) 論

SFE在加入乙醇作為夾帶劑后可有效從靈芝子實(shí)體萃取出靈芝三萜類(lèi)化合物，且萃取物中三萜類(lèi)化合物含量高。SMB的實(shí)驗(yàn)顯示：使用酸性流動(dòng)相可以有效移除非三萜成分；靈芝粗萃液中高極性雜質(zhì)含量較低極性雜質(zhì)含量多。SMB可有效地移除靈芝粗萃液中的雜質(zhì)，靈芝三萜類(lèi)化合物從進(jìn)料溶液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.51%提高至35.59%，大幅提高了靈芝酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。輔以三角形理論所建立的最佳操作條件，預(yù)測(cè)了本SMB系統(tǒng)在移除低極性雜質(zhì)時(shí)固定相的效率為0.061 kg/（L·d），而移除高極性雜質(zhì)時(shí)固定相的效率為0.423 kg/（L·d）。