張 欣，陳書曼，吳 楠，王 彤，裴興武，江連洲，韓翠萍*，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物甾醇由于具有高熔點(diǎn)和低溶解性的物理性質(zhì)而使其作為食品添加劑的使用受到限制。但是，將植物甾醇與脂類底物反應(yīng)生成植物甾醇酯，可以方便地添加到食品原料中，因?yàn)橹参镧薮减サ闹苄愿肹1]。目前，許多國(guó)家將植物甾醇酯添加到各類食品中以增加食品的功能性，在國(guó)內(nèi)也被作為新資源食品[2-3]。植物甾醇酯可以由植物甾醇和大豆油通過酯交換反應(yīng)生成。目前，可以通過化學(xué)法或者酶法合成植物甾醇酯，化學(xué)法生產(chǎn)植物甾醇酯過程中有副產(chǎn)物生成，產(chǎn)物需要分離除去催化劑等問題，而酶法生產(chǎn)植物甾醇酯則可以解決上述問題，同時(shí)溫和的反應(yīng)條件和生物催化劑的無(wú)毒性，可以提高生產(chǎn)效率[4]。

脂肪酶催化大豆油和植物甾醇酯交換反應(yīng)時(shí)，游離酶由于具有不易分離且成本較高等缺點(diǎn)在使用中受到限制。將游離脂肪酶固定化后，能夠增加單位面積內(nèi)酶分子數(shù)量，提高反應(yīng)效率，增強(qiáng)穩(wěn)定性，增加使用次數(shù)，容易從反應(yīng)中分離，從而有助于降低加工成本[5-6]。但是傳統(tǒng)的共價(jià)結(jié)合法固定是以酶蛋白上游離的活性基團(tuán)，如氨基、羧基、羥基、巰基等，隨機(jī)與載體共價(jià)結(jié)合，會(huì)使部分處在活性中心的活性基團(tuán)與載體結(jié)合形成新的鍵從而改變酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)，影響活性中心的作用效果，由此導(dǎo)致酶分子經(jīng)固定化后活性大幅度降低[7]。

分子對(duì)接方法是指通過化學(xué)計(jì)量學(xué)模擬已知結(jié)構(gòu)的受體（靶蛋白或活性位點(diǎn)）和配體間的相互作用識(shí)別，包括幾何結(jié)構(gòu)和分子間作用力，同時(shí)預(yù)測(cè)受體-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的一種方法[8-9]。南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）作為催化劑催化底物反應(yīng)時(shí)，活性中心起到主要作用，通過分子對(duì)接，可以獲得CALB與其他分子結(jié)合時(shí)作用的活性位點(diǎn)。酶分子表面具有多種活性基團(tuán)，如果在固定化過程中，使遠(yuǎn)離活性中心的活性基團(tuán)與載體進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，避免活性中心的參與，就能最大程度地保持酶分子活性中心的構(gòu)象不受影響，由此提高固定化酶的活性。

本實(shí)驗(yàn)通過分子對(duì)接技術(shù)研究CALB的活性中心，分析活性基團(tuán)在酶分子上分布的特點(diǎn)，針對(duì)活性基團(tuán)位置的分布特點(diǎn)，將MCM-41修飾成具有不同官能團(tuán)的載體，并分別與游離的CALB進(jìn)行固定化，研究修飾MCM-41載體對(duì)固定化CALB活性的影響。選取較優(yōu)的固定化CALB研究其催化一級(jí)大豆油與植物甾醇的酯交換率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CALB（活性1 780.0 U/mL） 北京高瑞森生物科技有限公司；MCM-41 南京先豐納米材料科技有限公司；γ-氨丙基三乙氧硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）（98%）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；一級(jí)大豆油、橄欖油（均為食品級(jí)）九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；植物甾醇、戊二醛等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海耀特儀器設(shè)備有限公司；AR2140電子分析天平 上海精密其有限公司；JSM-2010F型透射電子顯微鏡 日本日立公司；7890A氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；BPG-9056干燥箱上海一恒儀器有限公司；KQ-250V超聲波振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-1水浴鍋 上海越眾儀器設(shè)備有限公司；PHs-3C型pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 CALB活性中心及MCM-41修飾特性

1.3.1.1 CALB與配體分子對(duì)接

小分子的結(jié)構(gòu)采用Chemdraw 11.0進(jìn)行處理，將所得結(jié)果保存成mo12格式，然后用Autodock 4.0保存成pdbqt文件；通過同源建模獲得蛋白1GWC.pdb結(jié)構(gòu)，用Autodock 4.0處理蛋白結(jié)構(gòu)，通過加氫、計(jì)算電荷、合并非極性氫后保存成pdb文件，最后保存成pdbqt文件；打開大小分子的pdbqt文件，然后以蛋白的活性位點(diǎn)為中心（center x＝23.418，center y＝9.189，center z＝25.079），構(gòu)建一個(gè)60×60×60的盒子，保存成gpf文件，通過autogrid運(yùn)算生成glg文件；打開大小分子的pdbqt文件，利用默認(rèn)的軟件參數(shù)，小分子結(jié)構(gòu)采取柔性方式，運(yùn)算60 次，保存成dpf文件，通過Autodock運(yùn)算生成dlg文件[10-11]。

1.3.1.2 CALB的氨基酸殘基

通過在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB）中查找，得到CALB的氨基酸序列，查找出其中帶有活性基團(tuán)及氨基酸殘基，用RASWIN模擬出酶分子的結(jié)構(gòu)及氨基酸殘基分布，對(duì)CALB分子上的活性基團(tuán)所屬的氨基酸殘基位置分布進(jìn)行考察。

1.3.1.3 MCM-41的表面修飾

MCM-41氨基修飾：稱取2.5 g MCM-41于表面皿中，在150 ℃條件下放置在干燥箱中24 h。在150 mL無(wú)水乙醇中加入2 g MCM-41和2 g γ-氨丙基三乙氧基硅烷。將得到的懸濁液在5 000 r/min條件下進(jìn)行超聲分散處理30 min。再將得到的懸濁液600 W、22 000 Hz超聲振蕩處理30 min。將得到的懸濁液在水浴中加熱蒸發(fā)掉溶劑后，加入一定量的無(wú)水乙醇重復(fù)蒸發(fā)2 次，使用研缽研磨得到γ-氨丙基三乙氧基硅烷改性的氨基功能化MCM-41（NH2-MCM-41）[12]。

氨基功能化MCM-41的活化：在無(wú)水乙醇中加入20 mL NH2-MCM-41，再添加25%戊二醛溶液25 mL，在溫度40 ℃，攪拌速率200 r/min處理10 h，反應(yīng)結(jié)束后獲得的載體即帶有醛基活性基團(tuán)（G-MCM-41）。將獲得的載體分別用無(wú)水乙醇及去離子水沖洗4 次，再將其加入20 mL的去離子水中待用[13]。

1.3.1.4 修飾后的MCM-41載體固定CALB

G-MCM-41與CALB的固定：用磷酸緩沖液（pH 7.0）配制質(zhì)量濃度為14 mg/mL的CALB酶液，在50 mL酶液中加入100 mg制得的帶醛基活性基團(tuán)的載體G-MCM-41，45 ℃反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后，收集固態(tài)酶，得到載體與游離ε-NH2通過共價(jià)結(jié)合法固定的CALB（G-MCM-41-CALB），最后用磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌3 次，測(cè)定其酶活性[14]。

NH2-MCM-41與CALB的固定：參照Kuo等[15]的方法，將2 mg EDC（2.6 mmol/L）加入到4 mL含有脂肪酶的磷酸鹽（pH 8.5、50 mmol/L）緩沖溶液中，并將溶液25 ℃、150 r/min振蕩反應(yīng)1 h。然后，向溶液中加入2.4 mg NHS（5.2 mmol/L），反應(yīng)1 h，獲得被活性酯修飾過的酶。接著向溶液中加入50 mg表面修飾后的NH2-MCM-41，30 ℃、150 r/min振蕩反應(yīng)4 h，得到載體與—COOH通過共價(jià)結(jié)合法固定的CALB（NH2-MCM-41-CALB），最后用磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌3 次，測(cè)定其酶活性[16]。

1.3.2 活性高的固定化CALB催化大豆油與植物甾醇酯交換

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

稱取一定量的一級(jí)大豆油加入錐形瓶中，加入植物甾醇、固定化脂肪酶和轉(zhuǎn)子，置于集熱式磁力攪拌器中，攪拌速率為400 r/min，調(diào)整溫度，磁力攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后停止加熱，反應(yīng)物轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min離心20 min后，取出上層油脂制品。研究反應(yīng)溫度、固定化脂肪酶的添加量、植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響[17]。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface analysis

如表1所示，以反應(yīng)溫度、G-MCM-41-CALB添加量、植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間為自變量，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，研究各因素對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 CALB活性及相對(duì)酶活性的測(cè)定

CALB活性采用水解橄欖油乳化液的方法測(cè)定[18]。配制2%聚乙烯醇溶液，再加入橄欖油配成溶液，置于5～10 ℃水中，充分?jǐn)嚢?0 min，直至變成乳白色聚乙烯醇-油乳化液。以2.5 mL體積分?jǐn)?shù)25%橄欖油乳化溶液作為底物，加入2 mL、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），37 ℃水浴10 min后，加入0.5 mL游離脂肪酶（0.2 g固定化脂肪酶），在37 ℃水浴30 min后，加入5.0 mL乙醇-丙酮混合溶液（1∶1，V/V）終止反應(yīng)，然后加入5.0 mL 0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液，再用0.05 mol/L鹽酸溶液滴定反應(yīng)溶液，計(jì)算出游離脂肪酸含量，脂肪酶的一個(gè)活性單位定義為在測(cè)定條件下每分鐘釋放1 mmol脂肪酸的脂肪酶添加量。相對(duì)酶活性按式（1）計(jì)算：

1.3.3.2 酶蛋白負(fù)載量的測(cè)定

反應(yīng)體系中C A L B蛋白的質(zhì)量濃度測(cè)定采用Bradford[19]的方法，酶蛋白負(fù)載量按式（2）計(jì)算：

式中：C1和C2分別為反應(yīng)體系中起始和反應(yīng)后的CALB蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為反應(yīng)液的體積/mL；m為載體MCM-41質(zhì)量/g。

1.3.3.3 酯交換轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

通過氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)品的峰值。色譜柱：CP-Sil-88石英毛細(xì)柱（0.32 mm×5 m，0.1 μm）；程序升溫：150 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至370 ℃，保持5 min；分流比為80∶1；注入器和檢測(cè)器溫度為370 ℃；載氣為氦氣，流量7.0 mL/min。酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率按式（3）計(jì)算：

式中：植物甾醇和植物甾醇酯的峰值通過氣相色譜測(cè)得到，峰值區(qū)域與質(zhì)量濃度呈正比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CALB活性中心及修飾MCM-41固定化脂肪酶效果

2.1.1 分子對(duì)接結(jié)果

使用軟件將CALB與甘油三酯進(jìn)行分子對(duì)接，在對(duì)接過程中僅設(shè)定底物與酶的部分殘基可以移動(dòng)，酶的其它部分固定不動(dòng)。以CALB為受體，三亞油酸甘油三酯為配體，三亞油酸甘油三酯可由甘油與油酸酯化合成，由3 條結(jié)構(gòu)相同的支鏈組成，每條支鏈包含2 個(gè)雙鍵。經(jīng)過Chemdraw 11.0優(yōu)化后，得到三亞油酸甘油三酯的長(zhǎng)度值為29.9 ?。利用Autodock 4.0對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果如圖1所示。

圖1 CALB與配體對(duì)接結(jié)果Fig. 1 Lipase docking with ligand

從圖1可以看出，小分子配體主要通過疏水、氫鍵、范德化力進(jìn)入靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)，CALB與三亞油酸甘油三酯進(jìn)行了很好的對(duì)接，多種氨基酸參與了與配體的作用，CALB與甘三酯結(jié)合的活性中心是由Ser-105、Asp-187和His-224三個(gè)氨基酸殘基通過氫鍵組成的三維空間結(jié)構(gòu)，CALB的活性中心為三聯(lián)體“Ser-His-Asp”催化結(jié)構(gòu)，與Uppenberg等[20]的研究結(jié)果一致。

2.1.2 CALB的基團(tuán)組成

表2 CALB的氨基酸活性基團(tuán)及殘基個(gè)數(shù)Table 2 Number of amino acid active groups and residues in CALB

從PDB中的CALB 3D結(jié)構(gòu)，選定PDB ID∶4ZV7，如表2所示，在CALB氨基酸殘基中存在ε-NH2、—COOH、—OH及—SH等活性基團(tuán)?；钚曰鶊F(tuán)在酶分子中的組成對(duì)酶的固定化有重要作用，通過CALB活性基團(tuán)組成合理選擇修飾到載體上的官能團(tuán)種類[21]。

2.1.3 CALB分子的氨基酸殘基分布

經(jīng)分子對(duì)接結(jié)果可知，CALB分子催化三聯(lián)體為Ser-105、Asp-187和His-224，利用RASWIN軟件模擬得到具有4 個(gè)活性基團(tuán)的氨基酸殘基分布如圖2所示。

圖2 CALB分子的氨基酸殘基分布Fig. 2 Distribution of amino acid residues in CALB molecule

由圖2a可以看出，Lys殘基主要是游離ε-NH2活性基團(tuán)，Lys殘基的位置距離活性中心較遠(yuǎn)，游離ε-NH2的分布比較分散，在活性中心附近沒有發(fā)現(xiàn)游離ε-NH[22]。2由圖2b可以看出，Asp、Glu殘基主要是—COOH活性基團(tuán)，—COOH大部分分布在遠(yuǎn)離酶活性中心的位置上，僅一小部分分布在活性中心。由圖2c可以看出，Ser、Thr、Tyr殘基主要是—OH活性基團(tuán)，—OH含量多且分布范圍廣泛，并且在CALB催化活性中心分布較多，如果以—OH為結(jié)合位點(diǎn)，將會(huì)影響酶分子活性中心的活性。由圖2d可以看出，Cys殘基主要是—SH活性集團(tuán)，—SH含量較少，且分布較為分散，若以其為結(jié)合位點(diǎn)，固定化效率降低[23]。

因此，首先將MCM-41載體修飾成具有氨基官能團(tuán)的載體，以期能易與CALB的—COOH連接制得NH2-MCM-41-CALB。再將MCM-41載體修飾成具有醛基官能團(tuán)的載體，以期能易與CALB的ε-NH2連接制得G-MCM-41-CALB[24]，研究2 種官能團(tuán)載體對(duì)CALB固定化的效果。

2.1.4 修飾MCM-41載體固定CALB的效果

圖3 載體與CALB固定效果Fig. 3 Immobilization efficiencies of CALB with different carriers

由圖3可以看出，2 種載體固定得到的固定化CALB蛋白負(fù)載量均較高。用APTES對(duì)MCM-41載體改性得到的具有氨基官能團(tuán)的載體NH2-MCM-41表面含有大量氨基，而CALB蛋白上最容易與氨基反應(yīng)的基團(tuán)是羧基，因此可以推測(cè)當(dāng)CALB與NH2-MCM-41固定化時(shí)，改性后的載體NH2-MCM-41上大量的氨基與脂肪酶的羧基共價(jià)結(jié)合，制得的NH2-MCM-41-CALB活性較低，NH2-MCM-41載體加入戊二醛后得到的具有醛基官能團(tuán)的載體G-MCM-41與CALB固定時(shí)，CALB表面的氨基與載體表面的氨基通過戊二醛交聯(lián)固定[25]制成的G-MCM-41-CALB的活性較高。具有醛基官能團(tuán)的載體易與游離ε-NH2共價(jià)結(jié)合，CALB含有游離ε-NH2的Lys殘基分布在距離活性中心較遠(yuǎn)的位置（圖2a），生成的共價(jià)鍵遠(yuǎn)離活性中心，對(duì)酶的活性影響較小[26]。具有氨基官能團(tuán)的載體易與—COOH共價(jià)結(jié)合，CALB活性中心附近有一定量的—COOH（圖2b），并且由分子對(duì)接結(jié)果可知含有—COOH的Asp187為催化三聯(lián)體之一，當(dāng)氨基與CALB活性中心附近少量的—COOH形成共價(jià)鍵時(shí)，就會(huì)影響CALB分子的活性中心構(gòu)象，使NH2-MCM-41-CALB活性降低。

2 種不同官能團(tuán)的載體對(duì)CALB固定結(jié)果與CALB分子的氨基酸殘基分布結(jié)論吻合，具有醛基官能團(tuán)的載體與游離酶的ε-NH2結(jié)合制成的G-MCM-41-CALB活性較高，因此，后續(xù)僅研究G-MCM-41-CALB特性。

2.2 G-MCM-41-CALB催化大豆油與植物甾醇酯交換反應(yīng)的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 4 Effect of reaction temperature on transesterification rate

以一級(jí)大豆油為底物，pH值為7.0，植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%，酯交換時(shí)間5.0 h，G-MCM-41-CALB添加量為2.0%，攪拌速率400 r/min，結(jié)果如圖4所示。隨著體系反應(yīng)溫度的升高，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率呈先逐漸增加后逐漸降低的趨勢(shì)（P＜0.05），隨著溫度升高體系的黏度逐漸降低，反應(yīng)體系內(nèi)分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間的傳質(zhì)速率提高，促進(jìn)了酶顆粒與底物之間的相互作用，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到50 ℃時(shí)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，可能破壞了酶分子的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶分子的活性逐漸降低，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸降低（P＜0.05），這一結(jié)果與Takanami等[27]研究的結(jié)果一致。

2.2.2 G-MCM-41-CALB添加量對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 G-MCM-41-CALB添加量對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 5 Effect of G-MCM-41-CALB dosages on transesterification rate

以一級(jí)大豆油為底物，pH值為7.0，植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間5.0 h，攪拌速率400 r/min，結(jié)果如圖5所示。隨著G-MCM-41-CALB添加量的增加，大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸升高（P＜0.05），隨著G-MCM-41-CALB添加量的增加，G-MCM-41-CALB會(huì)提供較多的活性位點(diǎn)，增加了G-MCM-41-CALB與底物接觸碰撞的機(jī)會(huì)。當(dāng)G-MCM-41-CALB的添加量達(dá)到2.0%時(shí)，酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率上升不再明顯，這可能是因?yàn)榧用噶吭龆嗪螅妇奂谝黄鹗蛊渑c底物接觸的面積相對(duì)減少，脂肪酶不能更好地發(fā)揮其催化作用，從而導(dǎo)致酯交換轉(zhuǎn)化率上升不明顯，并且過多的酶用量也不利于產(chǎn)品精煉[28]。

2.2.3 植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖6 植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 6 Effect of phytosterol concentrations on transesterification rate

以一級(jí)大豆油為底物，pH值為7.0，反應(yīng)溫度50 ℃，酯交換時(shí)間5.0 h，G-MCM-41-CALB添加量2.0%，攪拌速率400 r/min，結(jié)果如圖6所示。隨著植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率呈先逐漸增加后逐漸降低的趨勢(shì)（P＜0.05）。隨著植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，增加了植物甾醇的羥基吸附固定化酶活性中心的幾率，大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸增加，當(dāng)植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%時(shí)大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值。隨著植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，植物甾醇在一級(jí)大豆油中的溶解度達(dá)到了飽和狀態(tài)，底物中植物甾醇的羥基與固定化酶活性中心的吸附與解吸達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸降低。這一結(jié)果與王騰宇等[29]研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)酯交換反應(yīng)的最佳植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 7 Effect of reaction time on transesterification rate

以一級(jí)大豆油為底物，pH值為7.0，反應(yīng)溫度50 ℃，植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%，G-MCM-41-CALB添加量2.0%，攪拌速率400 r/min，結(jié)果如圖7所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率呈先逐漸增加后趨于平穩(wěn)。在反應(yīng)起始階段，G-MCM-41-CALB的活性較高，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，G-MCM-41-CALB與底物之間的接觸充足，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸增加（P＜0.05），當(dāng)反應(yīng)時(shí)間3.0 h時(shí)，酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到了85.1%。隨著反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，G-MCM-41-CALB與底物之間的吸附與解吸達(dá)到平衡，酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化率增加緩慢（P＞0.05）。這一結(jié)果與Gharat等[30]研究結(jié)果一致，表明在最初的4 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率達(dá)到86.6%，但隨著反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行，酯交換反應(yīng)4 h后轉(zhuǎn)化率只有微小的變化。

2.3 G-MCM-41-CALB催化酯交換反應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)

如表3、4所示，將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到轉(zhuǎn)化率（R1）對(duì)反應(yīng)溫度（A）、G-MCM-41-CALB添加量（B）、植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）以及反應(yīng)時(shí)間（D）的回歸方程為R1=87.33-0.27A＋1.44B＋0.16C＋0.35D-0.18AB-0.11AC＋0.37AD-0.60BC＋0.18BD-0.91CD-9.49A2-3.48B2-3.21C2-3.77D2。

由表4可知，方程的自變量和因變量間具有顯著的線性關(guān)系，該模型回歸顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），并且該模型R2為0.999 1，R2Adj為0.998 2，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design scheme and experimental results for response surface analysis

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

圖8 各因素交互作用對(duì)酯交換轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig. 8 Response surface plots showing interactive effects of variables on transesterification rate

由圖8可知，2 個(gè)因素交互影響時(shí)，保持一個(gè)因素不變，轉(zhuǎn)化率隨著另一個(gè)因素變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其中，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、G-MCM-41-CALB添加量和植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和反應(yīng)時(shí)間之間交互作用較為顯著。通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到G-MCM-41-CALB催化酯交換反應(yīng)過程的最佳工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度49.92 ℃、G-MCM-41-CALB添加量2.1%、植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%、反應(yīng)時(shí)間3.05 h，該條件下轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)值為87.5%。根據(jù)實(shí)際情況將工藝參數(shù)進(jìn)行整理，得出整理值為反應(yīng)溫度50 ℃、G-MCM-41-CALB添加量2.1%、植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%、反應(yīng)時(shí)間3.0 h。為證明響應(yīng)面優(yōu)化出的條件下所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，得到的轉(zhuǎn)化率平均值為87.4%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，從而證實(shí)了模型的有效性。

3 結(jié) 論

將CALB與三亞油酸甘油三酯進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)活性中心由Ser-105、Asp-187和His-224構(gòu)成，在CALB活性中心發(fā)現(xiàn)大量的—OH及部分—COOH而沒有發(fā)現(xiàn)游離ε-NH2。根據(jù)CALB活性基團(tuán)的分布特點(diǎn)將MCM-41修飾成2 種不同官能團(tuán)的載體。具有氨基官能團(tuán)的載體易與—COOH結(jié)合，有部分結(jié)合位點(diǎn)在活性中心附近，使NH2-MCM-41-CALB活性降低。具有醛基官能團(tuán)的載體易與ε-NH2結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離活性中心，G-MCM-41-CALB具有較高活性。結(jié)果與CALB分子的氨基酸殘基分布結(jié)論吻合。G-MCM-41-CALB催化酯交換率達(dá)到87.4%。