黨 喬，孔令聰，劉 潔，劉樹明，魏 星，馬紅霞,*，閔偉紅,5,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；4.遼源市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 遼源 136220；5.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

乳酸菌是一類可通過(guò)發(fā)酵將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸的微生物，由于其具有兼性厭氧的特性，可廣泛存在于自然界中[1]。相關(guān)研究已證明乳酸菌不但可以調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、抗氧化，還具有緩解乳糖不耐癥、預(yù)防腫瘤和癌癥發(fā)生等益生功能[2]，其已廣泛用于醫(yī)療、食品、工業(yè)等領(lǐng)域[3]。目前用于食品工業(yè)中的乳酸菌主要包括乳酸桿菌、乳酸球菌、鏈球菌、明串珠菌等[4]。

隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳酸菌研究的不斷深入，更加推動(dòng)了乳酸菌制品的廣泛流行。但是由于乳酸菌缺乏嚴(yán)格的功效性和安全性認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)引發(fā)了一系列潛在的風(fēng)險(xiǎn)。其中，劣質(zhì)乳酸菌可能導(dǎo)致耐藥基因傳播以及誘發(fā)致病菌產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題，已經(jīng)引發(fā)了相關(guān)學(xué)者的高度關(guān)注[5]。雖然乳酸菌在食品發(fā)酵、青貯飼料等領(lǐng)域具有悠久的歷史[6]，但研究發(fā)現(xiàn)，有些乳酸菌不但對(duì)臨床常用藥物產(chǎn)生了抗藥性，還有可能將其攜帶的耐藥基因通過(guò)食物鏈傳遞給其他腸道及呼吸道致病菌，并賦予其耐藥性[7]。

泡菜是以蔬菜為原料通過(guò)乳酸菌發(fā)酵制得的傳統(tǒng)食品[8]，因其具有獨(dú)特的口感、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和易于儲(chǔ)存的優(yōu)點(diǎn)，深受人們喜愛(ài)。但其在食用之前并不經(jīng)過(guò)滅菌處理，造成大量的乳酸菌進(jìn)入人體[9]。因此，亟需對(duì)市售的泡菜發(fā)酵菌種進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，以期為乳酸菌安全性評(píng)估和泡菜質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品為吉林地區(qū)朝鮮族自制泡菜；細(xì)菌DNA基因組抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、Mueller-Hinton Broth（M-H肉湯）、Mueller-Hinton Agar（M-H瓊脂）青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 抗生素

氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢呋辛、克林霉素中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鏈霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫空氣浴搖床 常州國(guó)旺儀器制造有限公司；超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 丹陽(yáng)門石英玻璃場(chǎng)；微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；超低溫冰箱 中國(guó)海爾集團(tuán)；瓊脂糖凝膠電泳儀 北京市六一儀器廠；旋渦混合器 海門市麒麟醫(yī)用儀器場(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

將采集到的泡菜汁置于無(wú)菌超凈工作臺(tái)中，使用生理鹽水，將樣品10 倍梯度稀釋，分別取10-5、10-6、10-7三個(gè)梯度的稀釋液100 μL均勻涂布在含有2%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上，將涂布好的培養(yǎng)基置于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有明顯溶鈣環(huán)的不同形態(tài)菌落接種在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)24 h，再次劃線接種在MRS固體培養(yǎng)基上，經(jīng)分離純化3 次后，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色。將革蘭氏染色為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)為陰性的菌落增菌培養(yǎng)，在MRS液體培養(yǎng)基（含20%甘油）中-80 ℃保存。所有菌株在使用前都經(jīng)過(guò)3 次傳代培養(yǎng)。

1.3.2 乳酸菌16S rDNA基因測(cè)序鑒定1.3.2.1 乳酸菌DNA的提取

使用生工生物工程（上海）股份有限公司細(xì)菌DNA基因組抽提試劑盒提取分離菌株的基因組。

1.3.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增乳酸菌16S rDNA基因序列

使用16S rDNA通用引物，正向序列：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；反向序列：1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR體系為50 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，DNA模板4 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，加水補(bǔ)充至50 μL。

PCR擴(kuò)增程序設(shè)置如下，預(yù)變性：94 ℃、5 min；變性：94 ℃、30 s；退火：55 ℃、30 s；延伸：72 ℃、90 s；30 個(gè)循環(huán)；末端延伸：72 ℃、10 min。

1.3.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序

取2.5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在1 500 bp處有清晰條帶的樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。將得到的測(cè)序結(jié)果采用BLAST與NCBI中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)確定其屬種。

1.3.3 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定所分離乳酸菌對(duì)10 種抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。采用二倍稀釋法，制備抗生素質(zhì)量濃度為512～0.031 25 μg/mL且加入5%血清的MH瓊脂固體平板。所有待測(cè)菌株濃度調(diào)整為1×106CFU/mL，使用多點(diǎn)接種儀接種于含有不同抗生素的瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃中培養(yǎng)24 h。使用大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控株，每批實(shí)驗(yàn)均使用質(zhì)控株作為對(duì)照，并要求質(zhì)控株MIC在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)。使用不加抗生素的瓊脂平板作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌序列同源性比對(duì)結(jié)果

從1 5 份樣品中共分離出3 4 株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA測(cè)序分析，其分別屬于3 個(gè)屬13 種。分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）12 株，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）3 株，彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）1 株，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）2 株，棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）1 株，短乳桿菌（Lactobacillus. brevis）5 株，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）1 株，清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）2 株，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）2 株，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）2 株，食竇魏斯氏乳桿菌（Weissella crbaria）1 株，堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcus durans）1 株，Lactobacillus namurensis1 株。16S rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明泡菜中乳酸菌種類繁多，植物乳桿菌是本次采集的泡菜樣品中的優(yōu)勢(shì)菌株。

表1 乳酸菌16S rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果Table 1 Homologous analysis of lactic acid bacteria by 16S rDNA sequencing

2.2 乳酸菌對(duì)抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂稀釋法檢測(cè)從泡菜中分離到的34 株乳酸菌對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的敏感性。被測(cè)菌株的MIC如表2所示，藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲食品安全管理局（European Food Safety Authority，EFSA）[10]和Wang Jing等[11]。

表2 乳酸菌對(duì)10 種抗生素的MIC檢測(cè)結(jié)果Table 2 Minimum inhibitory concentrations of lactobacilli when exposed to ten antibiotics

結(jié)果表明，分離得到的34 株乳酸菌均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。對(duì)環(huán)丙沙星（85.29%，29/34），左氧氟沙星（61.76%，21/34），卡那霉素（52.94%，18/34），鏈霉素（50%，17/34），慶大霉素（29.41%，10/34），克林霉素（38.23%，13/34），紅霉素（20.5%，7/34），四環(huán)素（20.5%，7/34）均表現(xiàn)出不同的耐藥性。對(duì)氨芐青霉素和氯霉素全部敏感，對(duì)氨芐青霉素MIC不大于2 μg/mL，對(duì)氯霉素MIC不大于4 μg/mL。所測(cè)菌株對(duì)抗生素的耐藥情況為環(huán)丙沙星＞左氧氟沙星＞卡那霉素＞鏈霉素＞克林霉素＞慶大霉素＞紅霉素＞四環(huán)素＞氯霉素=氨芐青霉素。

2.3 乳酸菌多重耐藥性分析

大多數(shù)的乳酸菌都表現(xiàn)為多重耐藥，只有1 株鼠李糖乳桿菌和1 株腸膜明串珠菌對(duì)單一抗生素耐藥，其余菌株均對(duì)多種抗生素耐藥。5 株乳酸菌對(duì)2 種抗生素耐藥，7 株乳酸菌對(duì)3 種抗生素耐藥，12 株乳酸菌對(duì)4 種抗生素耐藥，4 株乳酸菌對(duì)5 種抗生素耐藥，1 株乳酸菌對(duì)6 種抗生素耐藥，乳酸菌耐藥表型分析如表3所示。乳酸菌多重耐藥性存在個(gè)體間差異，大多數(shù)乳酸菌均對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、鏈霉素耐藥。

表3 乳酸菌多重耐藥性Table 3 Multiple drug resistance of lactobacilli

2.4 不同菌種耐藥情況分析

本實(shí)驗(yàn)分離出植物乳桿菌數(shù)量最多為12 株，除6-1外，其余植物乳桿菌均對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，5 株對(duì)左氧氟沙星和慶大霉素耐藥，9 株對(duì)鏈霉素耐藥，3 株對(duì)克林霉素耐藥，6 株對(duì)卡那霉素和紅霉素耐藥。分離得到短乳桿菌5 株，全部對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥，30-1對(duì)四環(huán)素和紅霉素耐藥，27-1-2對(duì)四環(huán)素耐藥，26-2對(duì)卡那霉素耐藥，25-3對(duì)慶大霉素和鏈霉素耐藥，28-2對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥。2 株鼠李糖乳桿菌耐藥性較低，僅對(duì)卡那霉素和左氧氟沙星耐藥。腸膜明串珠菌1-1僅對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，P2對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥。干酪乳桿菌28-4和Z3均對(duì)卡那霉素和左氧氟沙星耐藥。2 株清酒乳桿菌耐藥譜相同，均對(duì)克林霉素、鏈霉素、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥。2株嗜熱鏈球菌和兩株干酪乳桿菌耐藥譜差異均較大。棒狀乳桿菌5-5、嗜酸乳桿菌4-1、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌32-1均對(duì)克林霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥，但也存在對(duì)其他抗生素耐藥性差異。

3 討 論

3.1 泡菜中乳酸菌分離鑒定

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，加入一定量的食鹽，在乳酸菌和酵母等微生物的厭氧發(fā)酵下，形成的有獨(dú)特口感的發(fā)酵食品[12]。國(guó)內(nèi)外多名學(xué)者均從泡菜中分離得到大量乳酸菌。Xiong Tao[13]和鄧維琴[14]等研究表明泡菜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌主要包括Lactobacillus pentosus、L. plantarum、L. brevis、Lactobacillus citreum和Leuconostoc mesenteroidessubsp.。孟令帥等[15]以沈陽(yáng)地區(qū)泡菜為原料，從中分離得到2 個(gè)屬6 種乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)以吉林地區(qū)傳統(tǒng)朝族泡菜為材料，分離得到3 個(gè)屬13 種乳酸菌，共計(jì)34 株。與上述報(bào)道略有差異，沒(méi)有分離得到L. pentosus和L. citreum，但是得到了泡菜中較為不常見(jiàn)的W. crbaria、E. durans和L. namurensis。這一差異結(jié)果可能與吉林地區(qū)特有的地理及氣候條件有關(guān)，不同環(huán)境中微生物種類和生物學(xué)特性有明顯差異，因此導(dǎo)致吉林地區(qū)泡菜中優(yōu)勢(shì)乳酸菌有獨(dú)特的地域特性，并且各家庭制作泡菜所用原料、制作工藝、溫度、時(shí)間存在差異，導(dǎo)致不同地區(qū)樣品中乳酸菌種類不同。本實(shí)驗(yàn)探究了吉林地區(qū)泡菜中乳酸菌種類及優(yōu)勢(shì)菌株，為吉林地區(qū)泡菜乳酸菌多樣性研究提供了參考，也為篩選出優(yōu)良的泡菜發(fā)酵乳酸菌奠定了基礎(chǔ)。

3.2 乳酸菌耐藥性

從吉林地區(qū)泡菜中分離得到34 株乳酸菌，采用瓊脂稀釋法檢測(cè)了10 種臨床常用抗生素的藥物敏感性，結(jié)果顯示34 株乳酸菌對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、卡那霉素、鏈霉素耐藥率較高，對(duì)慶大霉素、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素等均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，分離菌僅對(duì)氨芐西林和氯霉素全部敏感。大量研究表明，乳酸菌通常對(duì)抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素敏感，如氯霉素、紅霉素、克林霉素和四環(huán)素，也對(duì)細(xì)胞壁合成抑制劑如β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感[16-18]。但乳桿菌對(duì)大多數(shù)核酸抑制劑，如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星等以及氨基糖苷類抗生素，如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等通常具有耐藥性[19-20]。其耐藥機(jī)制主要受乳酸菌存在的藥物外排系統(tǒng)、甲基轉(zhuǎn)移酶以及產(chǎn)生的藥物滅活酶所介導(dǎo)[21-22]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前相關(guān)學(xué)者報(bào)道較一致[11,23-25]。但是Zhou[26]和張宏梅[27]等的藥敏結(jié)果顯示，受試乳酸菌對(duì)氨芐西林耐藥率較高，凡琴[28]、Moschetti[29]等發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的乳酸菌對(duì)慶大霉素較敏感。其不同的藥物敏感性結(jié)果可能與不同地區(qū)、不同環(huán)境中微生物面臨和承受的抗生素污染狀況不同有關(guān)，因此，不同地區(qū)、不同來(lái)源的乳酸菌應(yīng)進(jìn)行單獨(dú)分析。

總之，蔬菜通常被認(rèn)為是綠色安全食品，泡菜一般由蔬菜表面附著的乳酸菌發(fā)酵而成，很少會(huì)單獨(dú)添加乳酸菌制劑。由于抗生素的長(zhǎng)期使用和過(guò)度使用，環(huán)境中抗生素污染日益嚴(yán)重，且蔬菜在培育過(guò)程中受到化肥、澆灌用水、土壤等中的抗生素污染，導(dǎo)致了蔬菜表面的微生物產(chǎn)生了巨大的選擇壓力[30]。尤其在泡菜的制作過(guò)程中一般不會(huì)加入特定的乳酸發(fā)酵劑，僅由蔬菜表面的乳酸菌群發(fā)酵而成，使得耐藥性乳酸菌隨食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體健康造成潛在危害。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)泡菜中乳酸菌耐藥情況進(jìn)行分析，對(duì)環(huán)境中乳酸菌的安全性評(píng)估，及具有優(yōu)良風(fēng)味的安全乳酸菌發(fā)酵劑的篩選具有重要意義。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從吉林地區(qū)泡菜中分離得到34 株優(yōu)勢(shì)乳酸菌，其中包括3 個(gè)屬13 種。經(jīng)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所分離菌株對(duì)臨床使用較高的藥物呈現(xiàn)不同的耐藥性。因此，應(yīng)規(guī)范泡菜發(fā)酵菌種的使用，建立菌種質(zhì)量規(guī)范，以減少其耐藥基因的水平傳播給食品安全造成的風(fēng)險(xiǎn)。