薛 慧，付 玲，李洪波，王淑梅，劉 寧，張莉麗,*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；4.哈爾濱學(xué)院食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086）

鏈霉菌是革蘭氏陽性、多細胞、絲狀土壤細菌[1]。具有復(fù)雜的形態(tài)分化周期，包括孢子萌發(fā)產(chǎn)生分枝狀的基質(zhì)菌絲，基質(zhì)菌絲再發(fā)育成氣生菌絲和孢子[2]。除獨特的形態(tài)分化外，鏈霉菌另一個顯著特征是能夠產(chǎn)生廣泛的、具有重要價值的次級代謝產(chǎn)物。目前，國內(nèi)外許多研究都已證實，鏈霉菌復(fù)雜的形態(tài)分化與豐富的次級代謝產(chǎn)物和某些酶的合成之間有著密切的聯(lián)系[3-4]。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13）是茂原鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）生長分化過程中分泌的一種重要酶，它能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)，也可以使蛋白質(zhì)和氨基酸連接，還可以水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)的谷氨酰胺基，從而改變蛋白質(zhì)本身及其所附著的細胞和組織等的結(jié)構(gòu)和功能，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[5]?；谏鲜鎏匦訲Gase在食品工業(yè)[6]、生物醫(yī)藥[7]和紡織業(yè)[8]等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。TGase廣泛存在于人類、動植物和微生物[9-13]機體組織中，是生物體進行生命活動所需的一類非常重要的酶。其中關(guān)于人體內(nèi)TGase的生理功能研究最為深入，其作用包括凝血、傷口愈合、細胞凋亡、細胞分化和細胞間通信等[14]。

目前商品化的TGase主要來源于鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)，有關(guān)研究多集中于發(fā)酵條件優(yōu)化、篩選高產(chǎn)菌株以及利用基因工程技術(shù)對菌體進行改造以提高TGase產(chǎn)量，但效果不盡理想。而有關(guān)鏈霉菌合成TGase的生理功能研究卻鮮有報道，因此沒有建立起有效提高TGase產(chǎn)量的誘導(dǎo)策略?；诖?，本研究以S. mobaraensis為出發(fā)菌株，借助激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察TGase合成與菌體生存活力和形態(tài)分化的關(guān)系，進而揭示鏈霉菌TGase的生理功能，為提高TGase發(fā)酵生產(chǎn)水平提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茂原鏈霉菌DSM40587 日本NBRC公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-γ-單氧肟酸 美國Sigma公司；LIVE/DEAD Bac-Light bacterial viability kit試劑盒L-13152美國Invitrogen公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

斜面培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：聚蛋白胨20 g/L，可溶性淀粉20 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，酵母粉2 g/L，無水硫酸鎂2 g/L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：聚蛋白胨30 g/L，可溶性淀粉10 g/L，果糖10 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，酵母粉2 g/L，無水硫酸鎂1 g/L，氯化鎂25 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司；掃描電鏡日本日立公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城公司；高壓滅菌鍋 廈門致微公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)

用5 mL無菌生理鹽水將培養(yǎng)7 d的斜面孢子洗下，接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h后，按15%的接種量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)。

空白組按上述操作培養(yǎng)發(fā)酵120 h。實驗組分別在發(fā)酵0、24、48 h和72 h時，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.5 mol/L經(jīng)膜過濾的金屬蛋白酶抑制劑EDTA溶液，使EDTA的終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵至120 h。分別以0 h-EDTA、24 h-EDTA、48 h-EDTA和72 h-EDTA代表0、24、48 h和72 h添加EDTA實驗組。

1.3.2 菌體細胞生長量測定

將50 mL發(fā)酵液過濾后，用蒸餾水洗濾紙上菌體3 次，105 ℃干燥至質(zhì)量恒定后稱量[15]。

1.3.3 TGase活力測定

采用分光光度法[16]進行測定。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

SDS-PAGE采用5%的濃縮膠，電泳條件為80 V，30 min；12.5%的分離膠，電泳條件為120 V，1 h。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀察鏈霉菌菌體生存活力變化

菌體生存活力分析參照Fernandez等[17-18]方法。1 mL培養(yǎng)物12 000×g離心15 min，用水洗菌體2 次后，將菌體懸浮于水中。樣品與等體積LIVE/DEAD Bac-Light bacterial viability kit染色液混合，旋渦振蕩，室溫避光放置5～10 min。將20 μL混合液涂在載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡觀察。發(fā)射波長為488 nm和568 nm，吸收波長為530 nm和630 nm。得到的兩個圖像用Leica Confocal Software重疊得到菌體在發(fā)酵過程中激光共聚焦顯微圖像。

參照Gavet等[19]的方法，利用Image J軟件將紅、綠熒光強度轉(zhuǎn)化為灰度值，從而對菌體的生存活力進行定量分析，計算公式如下：

1.3.6 掃描電鏡觀察鏈霉菌形態(tài)學(xué)變化

參照Yuan等[20]的方法制備待觀察菌體樣本后，利用導(dǎo)電膠帶將凍干菌粉粘在樣品臺上，然后采用離子濺射的方法在樣品表面鍍上一層厚度約100～150 ?的金膜，最后借助掃描電鏡對菌體形態(tài)進行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3 次，每次2 個平行。計算菌體生存活力時，每個時間點選取15 個單獨的菌球體進行分析測定。實驗結(jié)果表示為。采用SPSS 15.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。2 組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，3 組或多于3 組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析的Duncan法進行兩兩比較分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. mobaraensis菌體生長周期和產(chǎn)酶變化

按照1.3.1節(jié)方法培養(yǎng)S. mobaraensis，每24 h取一次樣，測定菌體干質(zhì)量，繪制菌體生長曲線。如圖1所示，對照組中S. mobaraensis經(jīng)過24 h的適應(yīng)期后，菌體迅速生長進入對數(shù)期，96 h后生長緩慢進入穩(wěn)定期。各實驗組的生長趨勢與對照組相似，EDTA沒有影響菌體正常生長。

圖1 對照組和實驗組生物量變化曲線Fig. 1 Changes in biomass in the control and experimental groups

圖2 對照組和實驗組TGase活力變化曲線Fig. 2 Changes in TGase activity in the control and experimental groups

從圖2可以看出，對照組在適應(yīng)期時，發(fā)酵液中TGase活力處于較低水平；之后隨著生物量的增加，TGase活力也逐漸升高；發(fā)酵到96 h TGase活力達到最大為3.14 U/mL；隨著菌體生長進入穩(wěn)定期，TGase產(chǎn)量也開始下降。對照組不同時間點的發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析表明（圖3a），發(fā)酵初期S. mobaraensis主要以無活性的酶原（Pro-TGase）的形式分泌到胞外；隨著發(fā)酵的進行，Pro-TGase逐漸轉(zhuǎn)化為成熟的TGase；發(fā)酵到120 h，Pro-TGase幾乎全部轉(zhuǎn)化為TGase。實驗組自添加EDTA，發(fā)酵上清液中的TGase活力就不再升高或升高緩慢（圖2）。各實驗組的SDS-PAGE分析與酶活力測定結(jié)果一致（圖3），EDTA添加時間越早，對TGase產(chǎn)量的影響越大；即使72 h添加EDTA，直至發(fā)酵結(jié)束Pro-TGase也沒有完全轉(zhuǎn)化為TGase。上述實驗結(jié)果表明，添加EDTA不影響S. mobaraensis菌體生長，但能夠顯著抑制TGase活性。

圖3 對照組和實驗組發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of centrifugal culture supernatant in the control and experimental groups

2.2 發(fā)酵過程中S. mobaraensis菌體生存活力變化

圖4 對照組S. mobaraensis菌體在發(fā)酵過程中激光共聚焦顯微圖像Fig. 4 CLSM analysis of the development-linked cell death process of S. mobaraensis in the control group

圖4 表明對照組菌體在發(fā)酵過程中的生存活力變化，可以觀察到發(fā)酵過程中菌體呈放射狀菌球體生長。發(fā)酵到第24小時，菌球體中心出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，外部圍繞的活力菌絲中夾雜著紅色的死亡菌絲（圖4b）；隨著發(fā)酵時間的延長，菌球體中心紅色區(qū)域逐漸擴散（圖4d、e），而外部菌絲逐漸恢復(fù)活力（圖4c、f），發(fā)酵到第72小時的菌球體局部放大圖片（圖4f）顯示，菌球體外部幾乎全部由活力菌絲構(gòu)成，只在邊緣觀察到少數(shù)死亡菌絲；隨后菌球體活力再次下降（圖4g、j），第96小時和第120小時菌球體局部放大圖片也顯 示紅色菌絲數(shù)量逐漸增加。

圖5 0 h-EDTA實驗組S. mobaraensis菌體在發(fā)酵過程中激光共聚焦顯微圖像Fig. 5 CLSM analysis of the development-linked cell death process of S. mobaraensis in the 0 h-EDTA group

0 h-EDTA實驗組S. mobaraensis的菌體活力變化見圖5。與對照組中菌體生長狀態(tài)相同，發(fā)酵開始時菌體呈現(xiàn)出放射狀的小球體。第24小時菌球體中心的菌絲也開始死亡（圖5a），外部菌絲具有較高的活力（圖5b），只能觀察到少數(shù)死亡菌絲；但是與對照組不同的是，隨著發(fā)酵時間的延長，菌球體并沒有出現(xiàn)活力恢復(fù)的現(xiàn)象（圖5d、e、g、j），發(fā)酵至第120小時，菌體內(nèi)部和外部幾乎全部死亡，局部放大圖片也顯示紅色菌絲數(shù)量逐漸增多（圖5c、f、h、i）。其余3 組EDTA實驗組也出現(xiàn)隨著發(fā)酵的進行菌體逐漸死亡現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未給出）。

參照1.3.5節(jié)方法定量分析菌體生存活力，結(jié)果如圖6所示。對照組隨著生物量和TGase產(chǎn)量的升高，菌體生存活力也逐漸升高，發(fā)酵至第72小時菌體生存活力達到最大；隨后生物量和TGase產(chǎn)量繼續(xù)升高，菌體生存活力呈下降趨勢。實驗組菌體生存活力與TGase產(chǎn)量變化趨勢相一致，從加入EDTA時，菌體生存活力不再升高。結(jié)果表明，TGase有助于保持S. mobaraensis菌體生存活力，抑制TGase活性導(dǎo)致S. mobaraensis菌體生存活力下降。

圖6 對照組和實驗組中S. mobaraensis菌體生存活力變化曲線Fig. 6 Changes in viability of S. mobaraensis in the and experimental groups

2.3 發(fā)酵過程中S. mobaraensis菌體形態(tài)變化

掃描電鏡圖像（圖7）表明對照組菌體在發(fā)酵過程中的菌體形態(tài)變化。發(fā)酵至第24小時，菌體呈現(xiàn)彎曲狀態(tài)，菌絲表面能觀察到細小的淀粉樣顆粒（圖7a）；第48小時芽突開始大量萌發(fā)，淀粉樣顆粒增多（圖7b）；第72小時芽突進一步生長成小的分枝菌絲（圖7c）；第96小時菌絲體表面淀粉樣加劇，顆粒間相互連接形成疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖7d）；第120小時更多的淀粉樣顆粒附著于菌體表面，形成較為致密的呈褶皺狀的膜（圖7e）。

與對照組復(fù)雜的形態(tài)分化相比，0 h-EDTA實驗組的掃描電鏡圖（圖8）顯示該實驗組的菌體形態(tài)分化單一。發(fā)酵第24小時菌絲平直且表面光滑（圖8a）；第72小時才萌發(fā)出少量芽突（圖8c）；直至發(fā)酵結(jié)束也未觀察到有淀粉樣（圖8e）。其余3 組EDTA實驗組也都出現(xiàn)了菌體形態(tài)分化滯后的現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未給出）。

圖7 對照組S. mobaraensis菌絲在發(fā)酵過程中變化的掃描電鏡圖Fig. 7 SEM analysis of mycelial differentiation of S. mobaraensis in the control group

圖8 0 h-EDTA實驗組中S. mobaraensis菌絲在發(fā)酵過程中變化的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM analysis of mycelial differentiation of S. mobaraensis in the experimental group with EDTA addition at 0 h of culture

上述實驗結(jié)果表明TGase合成能夠促進S. mobaraensis形態(tài)分化，抑制TGase合成后S. mobaraensis形態(tài)單一，分化滯后。

3 討 論

S. mobaraensis合成TGase的過程復(fù)雜而嚴謹，Zotzel等[21-22]就S. mobaraensis產(chǎn)TGase的活化機制進行一系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S. mobaraensis為避免TGase在胞內(nèi)發(fā)生不可控制的交聯(lián)作用，以Pro-TGase形式分泌到胞外，先經(jīng)金屬蛋白酶（transglutaminase-activating metalloprotease；TAMEP）水解作用去掉41 個氨基酸形成中間體FRAP-TGase，然后再通過絲氨酸蛋白酶（tripeptidyl aminopeptidase；TAP）作用生成最終產(chǎn)物TGase。TAMEP是一種Zn金屬蛋白酶，本研究向含有MgCl2的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加EDTA，在中性pH值發(fā)酵條件下，EDTA不與Mg2＋螯合，而與蛋白酶上的Zn2＋螯合[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EDTA的添加沒有顯著影響菌體的生物量，但TGase的活力由添加EDTA時起不再升高。這表明，EDTA的添加抑制了TAMEP活性，阻止Pro-TGase向成熟的TGase轉(zhuǎn)化；激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡分析均表明，EDTA添加后，菌體形態(tài)分化延滯。結(jié)合激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察證明TGase參與維持S. mobaraensis的活力，保護菌體進行正常的形態(tài)分化。

鏈霉菌來源于土壤，由于生長環(huán)境復(fù)雜使其進化出獨特的形態(tài)分化模式[24]和代謝調(diào)控機制[25]。鏈霉菌在固態(tài)培養(yǎng)過程中，基內(nèi)菌絲可分化為氣生菌絲，在分化前期，基內(nèi)菌絲會通過分解胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等為氣生菌絲的生長供給營養(yǎng)物質(zhì)，該過程即為程序性死亡[3]。目前已經(jīng)在真核生物和酵母、芽孢桿菌中證實了TGase的合成與程序性死亡相關(guān)。鏈霉菌TGase的合成伴隨著程序性死亡開始進行[26]，并參與鏈霉菌氣生菌絲的形成[27-28]、構(gòu)成孢子表面復(fù)合蛋白膜[29-30]、改變菌絲細胞壁結(jié)構(gòu)[31]，而這些功能均與其交聯(lián)作用密切相關(guān)。因此推測在高濃度Mg2＋條件下，脅迫菌體進入程序性死亡[26]，刺激菌體啟動保護機制，大量合成TGase，交聯(lián)蛋白在菌體表面形成“防護層”（如對照組從發(fā)酵初期的淀粉樣，到發(fā)酵后期致密的膜狀物），以減弱外界環(huán)境的破壞，維持細胞完整結(jié)構(gòu)避免營養(yǎng)物質(zhì)外溢，保證菌體的正常分化。添加EDTA后，抑制了能使Pro-TGase轉(zhuǎn)化成活性TGase的關(guān)鍵金屬蛋白的活力，從而活性TGase合成受阻。由于TGase的活力降低，抑制了細胞表面蛋白的共價交聯(lián)，因而形態(tài)變得單一，不再有淀粉樣和膜狀物出現(xiàn)。

基于TGase合成與鏈霉菌菌體分化間的關(guān)系，在實際發(fā)酵生產(chǎn)過程中，可以通過環(huán)境脅迫作用，來誘導(dǎo)S. mobaraensis提高TGase的產(chǎn)量；另外還可以通過調(diào)控TGase合成的關(guān)鍵蛋白酶活力，進一步提高TGase產(chǎn)量。本研究只是從細胞水平觀察了TGase與S. mobaraensis的形態(tài)分化之間的關(guān)系，而TGase的合成機理尚不明確，還需要更深入的研究。