傅玲琳，黃健健，謝夢(mèng)華，王 翀，王彥波*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018）

近幾年來，食物過敏現(xiàn)象頻發(fā)，有研究表明，過敏人群在逐漸增加，全球大約有8%的兒童和4%的成人有過敏癥狀，研究認(rèn)為這與抗生素等藥物使用以及環(huán)境等因素有關(guān)[1]。食物過敏是一種對(duì)食物蛋白質(zhì)（即過敏原）產(chǎn)生的不良反應(yīng)，主要有3 種介導(dǎo)方式，分為由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)、非IgE介導(dǎo)以及IgE和非IgE混合介導(dǎo)，其中以IgE介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)最為嚴(yán)重，其在短時(shí)間內(nèi)會(huì)引發(fā)各類癥狀[2]。在食物過敏發(fā)生的過程中，T細(xì)胞十分重要，初始CD4＋T淋巴細(xì)胞受抗原刺激后能夠分化成Th1、Th2、Th9和Th17等幾種細(xì)胞亞型，分化的細(xì)胞類型受抗原類型、抗原遞呈細(xì)胞表以及細(xì)胞因子等共同作用，從而調(diào)節(jié)免疫過程[3]。Th17型細(xì)胞主要參與機(jī)體的自身免疫疾病與炎癥的發(fā)生，其分泌的細(xì)胞因子IL-17A能誘導(dǎo)IL-6等炎癥細(xì)胞因子聚集在炎癥部位，從而導(dǎo)致組織破壞[4-5]。

目前，小鼠、大鼠、豚鼠、犬和幼豬等多種動(dòng)物都被用于食物過敏實(shí)驗(yàn)研究，其中小鼠應(yīng)用最廣泛。常用的動(dòng)物模型有腹腔注射過敏原模型與經(jīng)口灌胃過敏原模型，后者能更好地反映生理狀況，研究結(jié)果更加可靠。但由于口服食物蛋白易使機(jī)體產(chǎn)生耐受[6]，故一般需要利用大劑量過敏原及黏膜佐劑。因此，部分研究者嘗試采用原核表達(dá)過敏原代替天然蛋白用于食物過敏相關(guān)研究[7-10]。但在構(gòu)建經(jīng)口致敏模型時(shí)仍需要大量過敏原刺激且仍需依賴黏膜佐劑，因此并未解決根本問題。早期研究發(fā)現(xiàn)將黏膜佐劑與抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性[11-13]，進(jìn)一步將黏膜佐劑與抗原共同原核表達(dá)，也能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，降低抗原使用劑量[14-15]。然而關(guān)于將黏膜佐劑與食物過敏原蛋白重組從而應(yīng)用于構(gòu)建動(dòng)物致敏模型的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究擬通過原核重組表達(dá)技術(shù)，將黏膜佐劑與過敏原形成融合蛋白，應(yīng)用于食物過敏動(dòng)物模型的構(gòu)建，并探索其優(yōu)越性。

霍亂毒素（cholera toxin，CT）是口服致敏模型中最常使用的黏膜佐劑，能夠增強(qiáng)小鼠Th2型免疫應(yīng)答。CT是由霍亂弧菌所產(chǎn)生的毒素，由1 個(gè)A亞基（CTA）和5 個(gè)B亞基（CTB）組成AB5形式[14]，其中CTB以五聚體形式存在，通過與腸上皮細(xì)胞表面GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合而進(jìn)入體內(nèi)[16]。由于CT的毒性，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制且中國海關(guān)限制進(jìn)口，開發(fā)更安全的CT替代品將會(huì)大幅促進(jìn)食物過敏研究。已有研究表明CT的兩個(gè)亞基均能增強(qiáng)黏膜免疫，可單獨(dú)作為黏膜佐劑使用，其中CTB由于無毒而應(yīng)用性更為廣泛[17-18]。例如在原核表達(dá)黏膜佐劑時(shí)，鑒于CT結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及毒性，常選擇單獨(dú)表達(dá)無毒的CTB作為黏膜佐劑。但由于CTB的聚集性，單獨(dú)表達(dá)CTB易形成包涵體而大大降低產(chǎn)量，故而有學(xué)者通過CTB與大腸桿菌周質(zhì)中的分子伴侶——SKP蛋白共表達(dá)，促進(jìn)CTB在原核表達(dá)時(shí)的溶解性[19]。

鑒于此，本研究采用原核表達(dá)中常用的促溶蛋白——麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein，MBP）[20-21]促進(jìn)CTB的可溶性表達(dá)。利用E. coliStbl3工程菌進(jìn)行分子克隆能有效降低錯(cuò)誤重組，E. coliBL21菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)能夠有效避免目的蛋白的降解。進(jìn)一步用高效轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞系對(duì)融合蛋白的表達(dá)以及跨膜能力進(jìn)行驗(yàn)證?；诖?，本研究利用同源重組，將MBP、CTB以及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）重組為融合蛋白MBP-CTB-EGFP，熒光探究MBP-CTB-EGFP能否跨越細(xì)胞膜，從而具有作為黏膜佐劑的潛力。此外用水產(chǎn)品中主要過敏原原肌球蛋白（tropomyosin，TM）構(gòu)建MBP-CTB-TM，并將其從大腸桿菌原核表達(dá)獲得的融合蛋白應(yīng)用于動(dòng)物致敏實(shí)驗(yàn)，探究融合蛋白的致敏性及其對(duì)小鼠食物過敏相關(guān)免疫反應(yīng)的影響，探索其是否能降低過敏原使用劑量，從而替代天然蛋白進(jìn)行TM相關(guān)的食物過敏研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

南美白對(duì)蝦購買于杭州蕭山養(yǎng)殖場；SPF級(jí)Balb/c小鼠采購并飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，共80 只，隨機(jī)分組，每組10 只。

E. coliStbl3、E. coliBL21、HEK293T細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株或細(xì)胞；pEX-4T-1-malE-egfp-10His、pEX-4T-1-malE-tm-10His均由本實(shí)驗(yàn)保存或構(gòu)建，攜帶N-端malE促溶標(biāo)簽和10×His親和純化標(biāo)簽，malE、egfp和tm基因分別表達(dá)MBP、EGFP和TM蛋白，其中，tm基因由課題組前期研究根據(jù)南美白對(duì)蝦基因組序列人工合成，并通過常規(guī)分子克隆替換pEX-4T-1-malE-egfp-10His中的egfp片段獲得[22]；pUC57-ctxB質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，其中，ctxB為CTB蛋白的基因；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）涉及的所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.2 試劑

FastDigestNotI 美國Thermo Scientific公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、質(zhì)粒提取試劑盒、Ni-NTA親和柱、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）相關(guān)用品 生工生物工程（上海）股份有限公司；高保真PCR試劑盒（Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase）、同源重組試劑盒（Clon Express?II One Step Cloning Kit） 南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；50×TAE緩沖液 北京諾博萊德科技有限公司；喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Goat Anti-Mouse IgG1-HRP、Goat Anti-Mouse IgG2a-HRP、Goat Anti-Mouse IgE-HRP 美國Southern Biotech公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）美國eBioscience公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國BD公司；胎牛血清FBS 美國Gbico公司；聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI） 美國Polysciences公司；Bio-Plex ProTM小鼠細(xì)胞因子試劑盒 美國Bio-Rad公司；其他普通化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini protein III垂直板電泳儀 美國Bio-Rad公司；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（配有ALPHAVIEW SA電泳圖像分析軟件） 美國Proteinsimple公司；VersaMax型酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；MLS-3750全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；瓊脂糖電泳儀 中國北京六一艾科儀器公司；普通PCR儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 MBP-CTB-EGFP及MBP-CTB-EGFP融合蛋白的原核重組表達(dá)

1.3.1.1 高保真PCR擴(kuò)增目的基因ctxB序列（含目的質(zhì)粒NotI酶切位點(diǎn)同源序列）

根據(jù)高保真PCR試劑盒擴(kuò)增pUC57-ctxB質(zhì)粒中的ctxB序列（含目的質(zhì)粒插入點(diǎn)同源序列）。反應(yīng)體系：25 μL 2×Phanta Max Buffer（含Mg2＋），1 μL dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL（約10 ng）模板DNA，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），18 μL ddH2O。上游引物：5’-ACAAGGACGACGATGACAAG-3’；下游引物：5’-TCCATTGCGCCGGCGCCTGC-3’。PCR程序：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、15 s變性，61 ℃、15 s退火，72 ℃、45 s延伸，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。取部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。

1.3.1.2 目的載體質(zhì)粒線性化

根據(jù)FastDigestNotI試劑盒說明書配制反應(yīng)體系：15 μL無核酸酶水，2 μL 10×FastDigest Buffer，2 μL（約1 μg）質(zhì)粒DNA，1 μL FastDigestNotI。反應(yīng)管放置到PCR儀中，37 ℃孵育30 min使環(huán)狀質(zhì)粒充分線性化，之后80 ℃加熱5 min使酶失活。

1.3.1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和目的載體的同源重組

根據(jù)同源重組試劑盒說明書設(shè)計(jì)及配制反應(yīng)體系：4 μL 5×CE II Buffer，3 μL線性化克隆載體，1 μLctxB擴(kuò)增產(chǎn)物（含目的質(zhì)粒插入點(diǎn)同源序列），2 μL Exnase?II，10 μL ddH2O。將反應(yīng)管置于PCR儀中，設(shè)置37 ℃、30 min，再永久4 ℃保存，取出前保證反應(yīng)液在4 ℃放置5 min以上。

同源重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板：取5 μL冷卻反應(yīng)液，加入到50 μLE. coliStbl3感受態(tài)細(xì)胞中，彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。42 ℃熱激45～55 s，冰水浴孵育2 min。加入1 mL LB培養(yǎng)基（無抗生素），37 ℃搖床孵育1 h，充分復(fù)蘇。取100 μL菌液均勻涂布LB瓊脂（含1‰ Amp）平板上。將平板倒置，于37 ℃培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)后，從平板上挑取分散良好的單菌落接種到5 mL的LB肉湯（含1‰ Amp），于37 ℃培養(yǎng)16 h，再進(jìn)行菌液PCR鑒定。挑選PCR正確的菌液送擎科生物有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選擇最匹配的菌液按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His、pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His并保存。

1.3.1.4 融合蛋白在E. coliBL21中的表達(dá)

將質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His及pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His分別轉(zhuǎn)化到E. coliBL21菌液，并進(jìn)行涂板，具體步驟同1.3.1.3節(jié)。挑取單菌落，轉(zhuǎn)移至5 mL的LB肉湯（含1‰ Amp）中，37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，獲得原核表達(dá)工程菌。

按照工程菌液：新鮮LB肉湯（含1‰ Amp）為1∶100接入工程菌液，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6～1.0（約3 h）。在超凈臺(tái)中加入IPTG（終濃度為0.1 mmol/L），立即放置于16 ℃或37 ℃（MBP-CTBEGFP為16 ℃，MBP-CTB-TM為37 ℃），200 r/min培養(yǎng)16～24 h。然后將菌液在室溫條件下4 000 r/min離心20 min，收集菌體，稱質(zhì)量。按照菌體濕質(zhì)量與酶解液（含0.2 mg/mL溶菌酶，20 μg/mL DNase，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF）1∶30的比例加入酶解液，吹打使菌體懸浮，然后置于4 ℃裂解30 min；在冰浴、超聲2 s-間歇5 s條件下，用超聲破碎機(jī)將裂解液超聲5 min，至液體顏色均一、無黏稠團(tuán)聚物質(zhì)。20 000×g離心20 min，收集上清液。沉淀重新加入酶解液重懸后再次20 000×g離心20 min，收集上清液，合并兩次上清液，并用0.45 μm濾膜過濾。之后按照Ni-NTA親和柱試劑盒說明書采用離心法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，并將洗脫液置于PBS中透析24 h，中間更換3 次PBS。隨后進(jìn)行SDS-PAGE：配制12%的分離膠與5%的濃縮膠，厚度為1.0 mm。將溶于PBS的TM取出少量，與4×蛋白質(zhì)SDSPAGE上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱5 min后取7 μL上樣。濃縮膠電壓120 V、10 min后，分離膠電壓180 V、40 min。

1.3.1.5 MBP-CTB-EGFP重組蛋白細(xì)胞膜穿透能力驗(yàn)證

對(duì)照組將1 μg質(zhì)粒、3 μL PEI和100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合均勻，靜置30 min后，均勻加入細(xì)胞，作用5 h后用顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)組取對(duì)數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞用胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)基，以每孔0.5 mL接種于24 孔板，培養(yǎng)1 d后，直接加入過0.22 μm濾膜的目的蛋白，終濃度為4 μmol/L，作用5 h后，用無菌PBS洗滌3 次，直接用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.3.2 Balb/c小鼠致敏模型

1.3.2.1 動(dòng)物致敏實(shí)驗(yàn)方案

將小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±3）℃、濕度（50±10）%的無菌飼養(yǎng)間，喂食小鼠基礎(chǔ)日糧。致敏處理開始前一周，按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通飲食飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)，小鼠自由進(jìn)食飲水，每日下午更換飼料。CTB-TM致敏組每周連續(xù)3 d灌胃600 μg溶于200 μL PBS的MBP-CTBTM，連續(xù)3 周，使小鼠致敏。第5周采用更高劑量（1 500 μg）進(jìn)行激發(fā)灌胃，1 周2 次，間隔4 d。PBS組每次灌胃與實(shí)驗(yàn)組等體積的PBS，CTB組每次灌胃與實(shí)驗(yàn)組等體積的含有CTB（250 μg）的PBS，TM組每次灌胃與實(shí)驗(yàn)組等體積的含有TM的PBS，免疫方案如圖1所示。第2次激發(fā)后對(duì)小鼠采用內(nèi)眥靜脈叢采血，血液于37 ℃孵育1 h，再3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取血清于新的EP管中，-80 ℃保存。取血后將小鼠處死，浸泡于75%乙醇溶液中，并在無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖，取其脾臟。

圖1 小鼠免疫方案Fig. 1 Mouse immunization protocol

1.3.2.2 血清TM特異性抗體IgE、IgG2a、IgG1的測(cè)定

小鼠血清TM特異性抗體IgE、IgG2a、IgG1抗體反應(yīng)均采用雙抗體夾心間接ELISA法檢測(cè)。EIA/RIA 96 孔板包被100 μL含10 μg/mL從天然蝦中提取純化的TM（具體提取方法參考傅玲琳等[23]），4 ℃孵育過夜；用PBS＋0.05%吐溫20洗滌3 次后，加入200 μL封閉液，37 ℃孵育1 h；洗滌3 次后加入100 μL稀釋后小鼠血清樣品（IgE 1∶6，IgG2a 1∶200，IgG1 1∶200），37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入100 μL辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（羊抗鼠IgG1-HRP、羊抗鼠IgG2a-HRP、羊抗鼠IgE-HRP），37 ℃孵育1 h；洗滌5 次后加入100 μL TMB底物，37 ℃避光孵育20 min后加入50 μL終止液，在450 nm波長測(cè)定各孔的OD值。

1.3.2.3 脾臟共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的測(cè)定

無菌條件下取出脾臟后置于200 目篩上，加入少量PBS，用無菌注射器輕輕研磨脾臟，使細(xì)胞過目篩，然后再加入少量PBS洗滌目篩，收集所有濾液于15 mL無菌離心管中，經(jīng)過紅細(xì)胞裂解，PBS洗滌2 次后，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素及鏈霉素雙抗）重懸細(xì)胞至106～107/mL。取1 mL加入12 孔板中，再加入已過0.22 μm濾膜的從蝦肉中提取的天然蛋白TM（終質(zhì)量濃度100 μg/mL），于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后離心收集細(xì)胞上清液。細(xì)胞因子采用Bio-Plex ProTM小鼠細(xì)胞因子試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His（圖2A），利用熒光探究MBP-CTB-EGFP是否能跨越細(xì)胞膜，從而具有作為黏膜佐劑的潛力。如圖2B所示，目的基因CTB片段克隆成功，條帶單一整齊，無雜條帶，效果較好。由圖2C可知，菌落PCR克隆成功，條帶位置單一，無雜條帶，位置在1 000～1 500 bp，靠近1 000 bp，與ctxB-egfp（約1 100 bp）的大小符合，表明pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His成功構(gòu)建。

圖2 質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His構(gòu)建Fig. 2 Construction of plasmid pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His

2.2 pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His質(zhì)粒構(gòu)建

圖3 質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His構(gòu)建Fig. 3 Construction of plasmid pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His

利用同源重組，將MBP、CTB以及水產(chǎn)品中主要過敏原TM重組為融合蛋白MBP-CTB-TM（圖3A），并進(jìn)行大腸桿菌原核表達(dá)獲得大量目的蛋白以為后續(xù)動(dòng)物模型構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。由圖3B可知，目的基因ctxB片段成功克隆，條帶單一整齊，無雜條帶，效果較好。由圖3C可知，ctxB-tm片段菌落PCR克隆成功，條帶位置單一，無雜條帶，位置在1 000～1 500 bp，也與ctxB-tm（約1 200 bp）的大小符合。

2.3 重組蛋白MBP-CTB-EGFP及MBP-CTB-TM表達(dá)及純化

圖4 融合蛋白MBP-CTB-EGFP與MBP-CTB-TM在E. coli BL21中的表達(dá)及純化Fig. 4 Expression in E. coli BL21and purification of fusion proteins MBP-CTB-EGFP and MBP-CTB-TM

從南美白對(duì)蝦中純化天然TM作為對(duì)照，SDA-PAGE結(jié)果如圖4A所示。利用大腸桿菌重組表達(dá)融合蛋白，由圖4B可知，Ni-NTA純化后MBP-CTB-EGFP融合蛋白純度較高，雜蛋白較少，SDS-PAGE圖只在上樣量非常大時(shí)才顯示有雜條帶。由圖4C、D的Western bolt和SDSPAGE結(jié)果可知，MBP-CTB-TM融合蛋白可在E. coliBL21中大量表達(dá)，且Ni-NTA純化后可得高濃度且純度較高的融合蛋白MBP-CTB-TM。經(jīng)過蛋白含量測(cè)定，MBP-CTB-EGFP和MBP-CTB-TM在大腸桿菌的表達(dá)量在50～80 mg/L培養(yǎng)液。且原核表達(dá)獲得的融合蛋白較從蝦肉中提取天然蛋白TM的方法，實(shí)驗(yàn)操作耗時(shí)短，毒性低，蛋白得率更高[24]。

2.4 MBP-CTB-EGFP重組蛋白細(xì)胞膜穿透能力驗(yàn)證

將融合蛋白與細(xì)胞共同孵育，利用EGFP的熒光效果，使用熒光顯微鏡觀察融合蛋白MBP-CTB-EFGP能否進(jìn)入細(xì)胞，因此驗(yàn)證其是否具有作為黏膜佐劑的潛力。如圖5可知，MBP-CTB-EGFP融合蛋白確實(shí)可穿過HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，說明MBP-CTBEGFP在原核表達(dá)后仍具有作為黏膜佐劑的能力，從而促進(jìn)外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，通過與MBP-CTB-EGFP基因利用轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞相比，MBP-CTB-EGFP融合蛋白攜帶外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率更高。

圖5 MBP-CTB-EGFP融合蛋白跨越細(xì)胞膜能力驗(yàn)證Fig. 5 Verification of the ability of MBP-CTB-EGFP fusion protein to cross cell membrane

2.5 融合蛋白MBP-CTB-TM對(duì)小鼠血清中TM特異性抗體的影響

圖6 小鼠血清中TM特異性IgE（A）、IgG1（B）、IgG2a（C）含量變化Fig. 6 Levels of TM-specific IgE, IgG1 and IgG2a in serum samples of mouse model

食物過敏主要由IgE介導(dǎo)，致敏機(jī)體攝入過敏原后，過敏原會(huì)迅速與致敏肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的特異性IgE結(jié)合，使肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、IL-4等炎癥因子，從而產(chǎn)生過敏反應(yīng)組織特異性癥狀[25]。此外，大量研究表明，食物過敏的發(fā)生與體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞平衡偏向于Th2細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)[26]，其中Th2型細(xì)胞因子促進(jìn)IgG1、IgE的分泌，而Th1型細(xì)胞因子則促進(jìn)IgG2a的分泌[27-28]。由圖6可知，融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠后，血清中均能檢測(cè)到高水平的TM特異性IgE、IgG1、IgG2a，初步表明融合蛋白MBP-CTB-TM確實(shí)可替代蛋白使小鼠產(chǎn)生TM特異性的抗體反應(yīng)。由圖6A可知，天然蛋白TM組與對(duì)照組IgE相比無明顯差異，但能誘導(dǎo)IgG產(chǎn)生，說明此劑量的蛋白引起口服免疫耐受而無法引起小鼠的過敏反應(yīng)，若引起過敏反應(yīng)需要更高劑量的TM。融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠，TM特異性IgE的相對(duì)含量（OD450nm）達(dá)到0.4，與實(shí)驗(yàn)室前期用天然蛋白獲免疫小鼠后的0.05相比[22]增加近8 倍，表明融合蛋白MBP-CTB-TM致敏效果更好，有可能達(dá)到降低過敏原用量的效果。此外，由IgG1和IgG2a的相對(duì)含量（OD450nm）可知，雖然兩者融合蛋白MBP-CTB-TM組相對(duì)于對(duì)照組而言均顯著提高，但I(xiàn)gG1水平明顯高于IgG2a，表明融合蛋白提高整體炎癥水平并導(dǎo)致體內(nèi)Th1/Th2免疫反應(yīng)不平衡。而MBP-CTB-TM組與TM組性比IgG1相對(duì)含量（OD450nm）無較大差別，且MBP-CTB-TM組IgG2a略低于TM組，說明融合蛋白在致敏后的抗體反應(yīng)中偏向于Th2型反應(yīng)。

2.6 融合蛋白MBP-CTB-TM對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

圖7 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度Fig. 7 Cytokines concentrations in culture supernatant of spleen cells of two Balb/c mouse models

研究證實(shí)食物過敏的發(fā)生與體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞平衡偏向于Th2細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。也有研究表明，Th17型細(xì)胞反應(yīng)主要與自身免疫疾病有關(guān)，與食物過敏的發(fā)生也存在相關(guān)性，當(dāng)食物過敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)，機(jī)體會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th17型免疫應(yīng)答并釋放大量IL-17、IL-6和IL-23等炎性細(xì)胞因子[29-30]。由2.5節(jié)IgE、IgG1、IgG2a水平變化，可以初步看出致敏小鼠體內(nèi)Th1/Th2免疫反應(yīng)偏向Th2，但是，由圖7可知，MBP-CTB-TM組中小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5并沒有顯著上升且都低于TM組，而Th17型細(xì)胞因子IL-6、IL-17A顯著上升且都高于TM組，且IL-17A的質(zhì)量濃度比TM組顯著增加，說明融合蛋白MBP-CTB-TM比天然蛋白TM更易于促進(jìn)Th17型反應(yīng)的發(fā)生，這表明融合蛋白MBP-CTB-TM雖可減低過敏原劑量且致敏小鼠，并使其產(chǎn)生TM特異性的抗體反應(yīng)，但其致敏機(jī)理可能與天然蛋白存在差異，將其代替天然蛋白應(yīng)用于食物過敏相關(guān)研究仍需謹(jǐn)慎，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳髦剡x擇。

3 結(jié) 論

近年來，隨著生活水平的提高，人們對(duì)甲殼類水產(chǎn)品例如蝦的消費(fèi)也逐漸增加，相關(guān)食物過敏問題的報(bào)道逐漸增加[31-32]。但大多數(shù)相關(guān)研究利用從蝦中直接提取純化得到TM作為過敏原開展實(shí)驗(yàn)，此過程實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長，蛋白得率低，結(jié)果不穩(wěn)定。本研究將MBP-CTB-EGFP、MBP-CTB-TM兩個(gè)重組蛋白在E. coli BL21中表達(dá)，重組蛋白表達(dá)量高，易于提取，不受季節(jié)影響，為后續(xù)采用重組蛋白構(gòu)建食物過敏動(dòng)物模型的研究提供了實(shí)驗(yàn)材料，有望減少抗原的使用量，縮短口服致敏模型構(gòu)建及機(jī)理研究的前期準(zhǔn)備時(shí)間。然而值得注意的是，原核重組表達(dá)的融合蛋白與多數(shù)真核過敏原相比，其致敏機(jī)理可能存在差異，故重組蛋白是否具有黏膜佐劑和過敏蛋白的作用，并產(chǎn)生1＋1＞2的效果仍是未知，需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究發(fā)現(xiàn)重組蛋白能導(dǎo)致Th17型細(xì)胞因子IL-6、IL-17A顯著上升，因此推測(cè)，其可能能夠作為研究Th17型疾病的有力工具。