鄧 姣，劉 鑫，成文豪，劉田田，周 軍，李湘洲,2,*

（1.中南林業(yè)科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.南方林業(yè)生態(tài)應用技術國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

營養(yǎng)、綠色和健康逐漸成為人們選擇食物的主流。根據世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全球75%的人處于亞健康狀態(tài)[1]，而我國亞健康人數隨著生活方式和節(jié)奏的改變也呈逐年上升的趨勢，開發(fā)具有改善亞健康人群健康狀態(tài)的功能保健食品成為食品領域的熱點。然而，許多具有生理活性的功能成分如維生素E、類胡蘿卜素、白藜蘆醇（resveratrol，RES）等存在水溶性差、不穩(wěn)定等缺陷，直接食用后難以被人體吸收與利用，因此開發(fā)功能食品輸送體系，最大限度提高功能成分的生物利用度已成為功能食品發(fā)展的關鍵[2-5]。

RES是一種非黃酮類天然多酚化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖、菝葜、桑椹、花生等多種植物組織器官中，具有明顯的抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、降血脂、抗血栓、誘導細胞凋亡及降低血糖等多種生物活性，使之備受關注[6-10]。RES是脂溶性成分，水溶性差，導致其在人體的生物利用度低，嚴重限制了RES功能產品的開發(fā)與應用。

過去數十年，應用于功能食品、藥品輸送體系的高分子材料種類繁多，包括合成的聚合物及天然產物中提取的大分子化合物，如多肽、多糖、蛋白等[11-15]。紫膠樹脂是寄生于植物上的紫膠蟲分泌的一種性質優(yōu)良的天然樹脂，具有易降解、無毒和機械性能與成膜性能良好等優(yōu)點。在醫(yī)藥方面，由于紫膠樹脂具有酸不溶性，將其作為腸溶藥物的包衣材料具有一定pH值響應性[16-17]。然而，紫膠樹脂水溶性差、耐熱性差等先天性缺陷限制了其應用。目前，對其改性研究主要是通過利用各種化學試劑對紫膠樹脂上的羧基、羥基、醛基等活性基團進行改性，來提高紫膠樹脂的熱壽命、軟化點，溶解性和機械物理性質等[18]。本研究以氨水對紫膠樹脂進行化學改性，改善其水溶性，并將制得的紫膠樹脂銨鹽（shellac resin ammonium salt，SRAS）應用于包埋RES，制備具有良好穩(wěn)定性和生物活性的RES功能食品，提高其在人體的生物利用度，促進RES功能產品的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫膠樹脂產于廣西；98% RES 花垣恒遠植化有限公司。

吐溫80、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸和、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技公司。

1.2 儀器與設備

DF-1集熱式磁力攪拌器 常州市江南實驗儀器廠；SCIENTZ-18N冷凍干燥儀 寧波新芝生物科技有限公司；Alpha紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司；DSC-8500差示掃描量熱儀 美國PerkinElmer公司；B-290小型噴霧干燥儀 步琦實驗室設備貿易（上海）有限公司；RC-3溶出度測試儀 天津市光學儀器廠；分析天平（最小分度0.000 1 g） 日本島津公司；TU1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 SRAS的制備

參考陳奇等[19]利用氨水對紫膠樹脂進行改性的方法制備SRAS，具體改性方法如下：精確稱量粉碎、過篩后的紫膠樹脂20 g，加入400 mL 0.1 mol/L NH3·H2O溶液中，于40 ℃恒溫磁力攪拌反應1 h，所得反應溶液靜置，取上層溶液裝入表面皿，于-18 ℃預凍12 h，真空冷凍干燥得到SRAS。

1.3.2 SRAS/RES微膠囊的制備

將適量RES分散于溶解好的SRAS溶液中，緩慢滴加少量吐溫80，50 ℃恒溫水浴下磁力攪拌1 h，冷卻至室溫，得到初乳液，立即進行噴霧干燥。噴霧干燥條件為：進風溫度140 ℃，出風溫度65 ℃左右，空氣流速50 L/h，進料速率6 mL/min。此條件下得到棕色粉末狀SRAS/RES微膠囊，備用。

1.3.3 RES標準曲線的繪制

1.3.3.1 RES-乙酸乙酯溶液標準曲線的繪制

精確稱量RES標準品30 mg于50 mL容量瓶，用乙酸乙酯溶解并定容。然后用吸量管量取RES乙酸乙酯溶液1 mL于100 mL容量瓶，定容。再以10 mL吸量管分別吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL上述溶液于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度線。得到質量濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 μg/mL的RES-乙酸乙酯標準溶液，并以乙酸乙酯溶液作參比，在波長305 nm處分別測定各濃度溶液的吸光度。得到標準曲線：y＝127.53x＋0.003 5，R2＝0.999 4，在1.2～6.0 μg/mL間擬合效果較好。

1.3.3.2 RES-磷酸鹽緩沖液標準曲線的繪制

精確稱量RES標準品8 mg于500 mL容量瓶用磷酸鹽緩沖液超聲溶解、定容、搖勻、靜置。分別吸取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL上述溶液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容。用無水乙醇作參比，在波長305 nm處分別測定各溶液的吸光度。以此繪制RES-磷酸鹽緩沖液的標準曲線。分別得到pH 1.0條件下的標準曲線為：y＝133.04x-0.014 6，R2＝0.999 4，在0.008～0.16 mg/mL間擬合效果較好；pH 6.8條件下的標準曲線為：y＝100.18x-0.002 4，R2＝0.999 9，在0.008～0.16 mg/mL擬合效果較好。

1.3.4 SRAS/RES微膠囊包埋率、負載率以及含水率的測定

精確稱取一定量的SRAS/RES微膠囊，用乙酸乙酯反復淋洗3 遍，過濾，濾液定容，于紫外-可見分光光度計下測吸光度，計算表面未包裹SRAS的RES量，并分別按式（1）和（2）計算RES的包埋率和負載率。另精確稱量一定質量的微膠囊于表面皿中，記為M1；保鮮膜密封后稱量表面皿總質量記為M2；冷凍干燥2 d后再次稱量，所得質量記為M3，含水率按式（3）計算。

1.3.5 掃描電鏡分析

分別取適量的RES和SRAS/RES微膠囊，粘在有導電膠的樣品臺上，在真空鍍膜機中噴金，然后用掃描電鏡觀察固體表觀形貌，分析制備前后微觀形貌的變化。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將空白微膠囊（不含RES）、RES標準品以及SRAS/RES微膠囊分別與干燥的KBr進行混合，研磨、壓片。在紅外光譜下掃描，掃描頻率64 Hz，掃描32 次，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.3.7 差示掃描量熱分析

分別取少量RES和SRAS/RES微膠囊至鋁制小坩堝中，封壓后放入差示掃描量熱測量儀。測量溫度范圍25～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。以液氮為降溫介質，加熱過程中均以高純N2為吹掃氣和保護氣。

1.3.8 抗氧化活性測試

1.3.8.1 SRAS/RES微膠囊清除DPPH自由基活性

配制79 mg/L的DPPH-乙醇溶液，低溫避光保存?zhèn)溆?。分別取RES和SRAS/RES微膠囊溶于乙醇中，使兩者的RES質量濃度均為200、400、600、800、1 000 μg/mL。分別取0.5 mL不同質量濃度的RES和SRAS/RES樣液，加入5.0 mL的DPPH-乙醇溶液混合均勻，37 ℃反應1 h，以相應乙醇為空白，在波長為517 nm處比色，按式（4）計算DPPH自由基清除率：

1.3.8.2 SRAS/RES微膠囊清除ABTS陽離子自由基活性

分別配制3.84 g/L的ABTS溶液以及1.34 g/L的過硫酸鉀溶液，兩者按體積比1∶1混合，避光12 h得ABTS工作液，低溫下避光保存?zhèn)溆?。臨用前稀釋為734 nm波長處吸光度為0.7的工作液。分別取RES和SRAS/RES微膠囊溶于乙醇中，使兩者的RES質量濃度均為40、60、80、100、120 μg/mL。分別取0.5 mL不同質量濃度的RES和SRAS/RES樣液，加入10.0 mL ABTS-乙醇溶液混合均勻，37 ℃反應1 h，以相應乙醇為空白，在波長為734 nm處比色，按式（5）計算ABTS陽離子自由基清除率：

1.3.9 體外釋放性能

采用透析法考察SRAS/RES微膠囊的體外釋放行為[20]。以不同pH值（1.0和6.8）的磷酸緩沖鹽溶液作為釋放介質，考察SRAS/RES微膠囊在不同pH值條件下的釋放性能。分別稱取定量RES、SRAS/RES微膠囊置于截留分子質量為14 000 Da的透析袋內，夾緊后置于400 mL磷酸鹽緩沖液釋放介質中。在溫度37 ℃、轉速100 r/min的溶出度測試儀中進行釋放實驗，一定時間后取樣5 mL，同時向其中補加5 mL新鮮的磷酸鹽緩沖液釋放介質。樣液用紫外-可見分光光度計測量吸光度，計算RES累積釋放率。

1.4 數據處理與分析

所有數據均采用Origin 8.0軟件進行數據分析與作圖，每組實驗設置3 次平行實驗，結果以表示。

2 結果與分析

2.1 SRAS/RES微膠囊制備工藝優(yōu)化

調節(jié)配方中固形物的配比，可以獲得芯材包埋率、負載率均較優(yōu)的工藝參數。由表1可知，固定乳化劑吐溫80的用量，壁材SRAS的用量增大后，芯材RES的包埋率隨之增大；當芯材RES的用量增大后，其包埋率減小，而負載率增大。不加RES的空白微膠囊的含水率較高，而其他配方組的含水率均較穩(wěn)定，說明利用噴霧干燥法制備SRAS/RES微膠囊的工藝穩(wěn)定。在所有配比中，當SRAS和RES的用量分別為2、0.278 g時，RES的包埋率和負載率接近理論值，此條件下包埋效果較好，因此，SRAS/RES微膠囊的制備配方為2 g SRAS、0.278 g RES和0.5 g吐溫80，此條件下，RES的包埋率為82.70%、負載率為8.27%。

表1 不同配方條件下RES的包埋率、負載率及含水率Table 1 Encapsulation efficiencies, load rates of RES and moisture contents in different formulations

2.2 SRAS/RES微膠囊掃描電鏡分析

圖1 RES（a）和SRAS/RES微膠囊（b）掃描電鏡分析Fig. 1 SEM analysis of RES (a) and SRAS/RES (b) microcapsules

由圖1a可知，RES形態(tài)大多為細長的無規(guī)則晶體結構。由圖1b可知，SRAS包埋后噴霧干燥得到的微膠囊多為表面光滑的球狀結構，粒度分布均勻，粒徑約2～4 μm，顆粒之間有一定的黏連性，與未被包埋的RES相比，結構和粒度均有明顯變化，表明SRAS對RES具有較好的包埋效果。

2.3 SRAS/RES微膠囊傅里葉變換紅外光譜分析

圖2 RES、空白微膠囊以及SRAS/RES微膠囊傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 2 FT-IR analysis of RES, blank sample and SRAS/RES microcapsules

由圖2可知，RES紅外光譜圖中3 220 cm-1附近為酚羥基特征吸收峰，1 608、1 588 cm-1和1 513 cm-1附近為苯環(huán)特征吸收峰，指紋圖譜區(qū)965 cm-1附近為RES的反式—C＝C—的特征吸收峰，672 cm-1附近為順式—C＝C—的特征吸收峰[21]?？瞻孜⒛z囊中1 559 cm-1處為紫膠樹脂中的R—COO-以離子鍵與氨水中游離的NH4＋結合形成的中等強度的酰胺基特征吸收峰。SRAS/RES微膠囊相比于空白微膠囊，不僅具有空白微膠囊的特征吸收峰，還出現了RES苯環(huán)特征吸收峰以及指紋圖譜區(qū)的965、832、672 cm-1特征吸收峰，同時3 220 cm-1附近吸收峰明顯增強均體現了RES的影響，以上均可說明SRAS對RES進行了有效包埋，形成了穩(wěn)定的SRAS/RES微膠囊。

2.4 SRAS/RES微膠囊差示掃描量熱分析

當RES被SRAS包埋后，可能會引起SRAS/RES微膠囊的熱力學性質的改變。為驗證微膠囊的熱力學穩(wěn)定性，按1.3.7節(jié)中所述方法對RES、SRAS/RES微膠囊進行了差示掃描量熱分析，結果見圖3。

圖3 RES和SRAS/RES微膠囊差示掃描量熱分析Fig. 3 DSC analysis of RES and SRAS/RES microcapsules

在微膠囊眾多熱性質中，玻璃化轉變溫度是判斷微膠囊優(yōu)異性質的重要指標，這是因為當貯藏溫度高于玻璃化轉變溫度時，微膠囊所使用的壁材在微觀上因分子鏈開始活動，致使芯材向外擴散和外界物質進入微膠囊的速率增加，從而使產品質量下降[22]。由圖3可知，所有物質在50～100 ℃均有輕微的吸熱峰，這可能與水的流失有關。RES樣品在266.98 ℃有一個尖銳的吸熱峰，對應RES的玻璃化轉變溫度。而SRAS/RES微膠囊則沒有發(fā)現尖銳的吸熱峰。因此，通過改性的天然高分子材料SRAS對RES進行包埋可以有效提高其熱力學穩(wěn)定性。

2.5 SRAS/RES微膠囊抗氧化活性分析

圖4 RES和SRAS/RES微膠囊清除DPPH自由基的能力Fig. 4 DPPH radical scavenging activities of RES and SRAS/RES microcapsules

圖5 RES和SRAS/RES微膠囊清除ABTS陽離子自由基的能力Fig. 5 ABTS cation radical scavenging activities of RES and SRAS/RES microcapsules

如圖4所示，RES和SRAS/RES微膠囊清除DPPH自由基能力隨用量的增加而增大，其抗氧化能力增強。同等RES質量濃度下，SRAS/RES微膠囊清除DPPH自由基的能力略高于RES。經計算可得RES清除DPPH自由基的IC50為369.7 μg/mL，而SRAS/RES微膠囊的IC50為347.86 μg/mL[23-24]。由圖5可知，RES和SRAS/RES微膠囊清除ABTS陽離子自由基能力同樣隨其質量濃度的增加而增大。其中，在低質量濃度下，SRAS/RES微膠囊清除ABTS陽離子自由基的能力要高于RES，隨著質量濃度增加，兩者體外抗氧化能力基本一致。經計算可得RES清除ABTS陽離子自由基的IC50為39.98 μg/mL，SRAS/RES微膠囊的IC50為32.44 μg/mL。

相對于游離態(tài)的RES，經SRAS包埋后微膠囊對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力均有所提高，表明抗氧化能力更強，這可能是由于反應介質中的RES在微膠囊體系具有較大的表面積所致[25-28]。上述結果表明利用噴霧干燥法制備的SRAS/RES微膠囊性能穩(wěn)定，具有良好的體外抗氧化活性。

2.6 SAS/RES微膠囊體外釋放性能分析

功能食品或藥物輸送體系經人體攝入一般需要經過口腔、胃，再到小腸吸收后進入人體的血液循環(huán)中，整個過程大約需要3～16 h，含淀粉類成分較低的輸送體系可忽略口腔消化的影響。因此，對于理想的功能食品或藥物輸送體系，應能夠在胃部強酸性環(huán)境下（pH 1.0～2.5）保持穩(wěn)定，而進入腸道環(huán)境（pH 5.1～7.8）后能在較短時間內（8～10 h）充分釋放出功能因子，避免其提前釋放，有助于腸道內吸收。

圖6 pH 1、6.8條件下RES和SRAS/RES微膠囊的累積釋放率Fig. 6 Cumulative release rate of RES and SRAS/RES microcapsules at pH 1 and 6.8

由圖6可知，在pH 1的模擬胃液條件下，4 h內，RES樣品與SRAS/RES微膠囊中RES的累積釋放率均隨時間的延長而增大，但SRAS/RES微膠囊中RES的釋放速率明顯小于RES樣品，4 h的累積釋放率分別為34.26%、13.99%。在pH 6.8的模擬腸液中，在開始的2 h（通常食物和藥物從胃到達小腸的時間為2 h左右）內[29-30]，SRAS/RES微膠囊中RES迅速釋放，出現明顯的突釋現象，而后隨著時間的延長，RES的累積釋放率增大，14 h內，RES的累積釋放率從13.99%升至65.84%；而RES樣品隨時間的延長累積釋放率均勻增大，14 h內，RES的累積釋放率從34.26%升至70.24%。

已有研究表明，紫膠含有較多的羧基等活性基團，紫膠的解離常數較大，其羧酸基團不易解離，導致其在弱堿環(huán)境中的溶解性較差，藥物無法得到有效釋放。通過氨水改性后制備得到的SRAS，其在強酸性條件下的溶解度較低，而隨pH值的增大，SRAS的溶解度逐漸增大，當pH值為7.0時，其溶解率達到最大[19,31]。在弱堿性條件下，SRAS/RES微膠囊的壁材SRAS快速溶解，使得芯材RES迅速釋放出來。因此，SRAS/RES微膠囊相比于RES具有明顯的緩釋效果，SRAS/RES微膠囊能在模擬人體胃液環(huán)境下緩釋釋放，而在模擬人體腸液中釋放速度較快，具有pH值響應性，有利于RES在腸液中的吸收，并提高RES的生物利用度。

3 結 論

以氨水改性的SRAS為壁材，利用噴霧干燥技術制備SRAS/RES微膠囊，獲得制備工藝為SRAS用量2 g、RES用量0.278 g、吐溫80用量0.5 g，此條件下制備的SRAS/RES微膠囊包埋率達到82.70%，負載率為8.27%。

利用掃描電鏡、傅里葉變換紅外光譜、差示掃描量熱技術對SRAS/RES微膠囊的性能進行表征，結果表明，RES被SRAS包埋，形成表面光滑、球體結構的微膠囊，熱力學性質更穩(wěn)定。SRAS/RES微膠囊的抗氧化能力高于未包埋前的RES的抗氧化能力，SRAS/RES微膠囊清除DPPH自由基的IC50為347.86 μg/mL，清除ABTS陽離子自由基的IC50為32.44 μg/mL。SRAS/RES微膠囊能在3 種模擬人體體外環(huán)境下進行緩釋釋放。SRAS/RES微膠囊具有pH值響應性，其在模擬人體胃液環(huán)境下保持緩釋釋放，而在模擬人體腸液中釋放速度快，具有促進RES在腸液中的吸收及提高其生物利用度的潛在作用，在功能食品、藥品輸送體系中具有較好的應用前景。