王小鵬，趙新淮*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）途徑蛋白質(zhì)糖基化修飾反應（酶法糖基化修飾）是在TGase催化下，蛋白質(zhì)（肽）的谷氨酰胺殘基（酰基供體）和氨基糖的伯胺基團（?；荏w）發(fā)生共價交聯(lián)反應，生成糖基化交聯(lián)修飾產(chǎn)物，被修飾產(chǎn)物兼具蛋白質(zhì)的大分子特性和糖類的親水特性，表現(xiàn)出良好的溶解性、乳化性、膠凝性及熱穩(wěn)定性[1-2]。TGase途徑糖基化可以在低溫條件下、短時間內(nèi)對食品蛋白質(zhì)進行專一性修飾，生成結構明確的蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物[3]，避免了美拉德反應途徑糖基化反應周期長、反應進程難以控制、副產(chǎn)物眾多、有對健康不利產(chǎn)物生成等缺陷[4-6]，是一種新型、安全的食品蛋白質(zhì)糖基化修飾技術。

相對于TGase交聯(lián)作用在食品工業(yè)中廣泛應用[7-8]，TGase催化蛋白質(zhì)糖基化的研究起步較晚，目前仍處于基礎研究階段。2010年起，本課題組[9-11]利用TGase先后將氨基葡萄糖、殼寡糖、低聚殼聚糖、降解殼聚糖等連接到了酪蛋白、大豆分離蛋白、脫酰胺酪蛋白、脫酰胺大豆分離蛋白上，被修飾產(chǎn)物的持水性、膠凝性、流變學性質(zhì)顯著改善：相對于酪蛋白，氨基葡萄糖糖基化酪蛋白的持水性提高4.4 倍，吸油性提高1.5 倍；殼寡糖糖基化修飾后，大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性分別增加34%和5.3%。近年來，人們在研究TGase途徑糖基化對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和微觀結構改善的同時，更多關注了這一新型糖基化修飾技術的應用前景。Gottardi[12]和Hong[13]等發(fā)現(xiàn)谷蛋白、火雞肉蛋白水解物經(jīng)TGase途徑氨基葡萄糖糖基化修飾后，產(chǎn)物中美拉德反應中末期產(chǎn)物（AGEs）和二羰基化合物含量降低，被修飾產(chǎn)物的抗氧化、抗菌性顯著增加；Yuan Fangzhou等[14]發(fā)現(xiàn)TGase途徑氨基葡萄糖糖基化修飾可以改變蝦原肌球蛋白的二級結構，以溫和的方式降低蝦制品導致的過敏反應。Xu Yujuan等[15]通過TGase途徑氨基葡萄糖糖基化，有效提升了PSE（pale, soft and exudative）雞胸肉的食用特性和經(jīng)濟價值。上述研究表明，TGase途徑糖基化作為一種新興的蛋白質(zhì)修飾技術具有巨大的應用前景；然而，蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化修飾后，其消化性是否受到影響，是制約其工業(yè)化應用的關鍵，目前還沒有研究涉及。

本研究利用TGase催化制備殼寡糖糖基化酪蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、反相-高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）證實糖基化修飾反應的發(fā)生；以水解度（degree of hydrolysis，DH）和三氯乙酸可溶性氮（trichloroacetic acid soluble nitrogen，TCA-SN）為指標分析糖基化修飾對蛋白質(zhì)體外消化能力的影響；葡聚糖凝膠過濾色譜分析消化物中肽組分分子質(zhì)量分布情況，以期科學評價TGase途徑糖基化修飾對蛋白質(zhì)消化性的影響，為新型蛋白質(zhì)配料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、SDS、考馬斯亮藍R-250 美國Sigma公司；TGase（E.C. 2.3.2.13，1.1×102U/g） 江蘇一鳴精細化工有限公司；葡聚糖凝膠G-25 美國GE Healthcare公司；殼寡糖（分子質(zhì)量1 kDa，脫乙酰度90%） 浙江金殼藥業(yè)有限公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽、鄰苯二甲醛 美國Amresco公司；胃蛋白酶（E.C. 3.4.23.1，4×104U/g）、胰蛋白酶（E.C. 3.4.21.4，1.2×105U/g） 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

2695 RP-HPLC系統(tǒng) 美國Waters公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；Alpha 1-4中型凍干機德國Matin Christ公司；AKTA Purifier10蛋白純化系統(tǒng)美國GE Healthcare公司；L-8800型氨基酸自動分析儀日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 TGase途徑殼寡糖糖基化酪蛋白（糖基化酪蛋白）的制備

參照Song Chunli等[10]的方法制備糖基化酪蛋白。酪蛋白溶液（50 g/L）與調(diào)整至中性的殼寡糖溶液均勻混合，?；w與酰基受體的物質(zhì)的量比為1∶3，TGase添加量10 U/g（占酪蛋白比例計），pH 7.5，37 ℃反應180 min；滅酶后酸沉水洗，回調(diào)pH值至中性，凍干后即為糖基化酪蛋白。酪蛋白（不添加TGase）同樣處理作為對照。

1.3.2 糖基化酪蛋白的SDS-PAGE驗證

SDS-PAGE和考馬斯亮藍蛋白質(zhì)染色參照Fan Yuting等[16]的方法，糖染色參照Zacharius等[17]的方法，略有改動。分離膠、濃縮膠分別為12%、4%。同時制備兩塊膠，對應位置點相同的樣品，一塊用于蛋白染色，一塊用于糖染色，每孔上樣15 μL，濃縮膠電壓80 V，電流20 mA；待樣品進入分離膠后，調(diào)整電壓至120 V，電流35 mA。分別進行蛋白質(zhì)染色與脫色、糖染色與脫色后，利用佳能50 D相機對膠片進行圖像處理。標準蛋白分子質(zhì)量為14.4～97.4 kDa。糖蛋白-辣根過氧化物酶用作陽性對照，同樣處理的酪蛋白作為陰性對照。

1.3.3 糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖導入量的RP-HPLC檢測

1.3.3.1 樣品處理

氨基葡萄糖導入量的檢測參考Zhu Changyue等[11]的方法略有改動。取2 mL糖基化酪蛋白溶液（50 g/L）于安瓿瓶中，加入2.0 mL鹽酸，100 ℃水解6 h。取0.3 mL水解液、0.7 mL硼酸緩沖溶液以及0.3 mL衍生試劑（0.5%鄰苯二甲醛甲醇溶液），衍生后上機檢測。

1.3.3.2 色譜條件

流動相A液：乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 3.6）；流動相B液：甲醇溶液。色譜柱為C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A-B（60∶40，V/V）；進樣量10 μL；流速0.5 mL/min，色譜柱溫38 ℃；熒光檢測器的激發(fā)波長337 nm，發(fā)射波長454 nm。

1.3.3.3 氨基葡萄糖標準曲線的繪制

配制1 g/L的氨基葡萄糖母液，稀釋至0.5、1、2、5、10、20 mg/L，檢測氨基葡萄糖的含量，繪制標準曲線。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測定

采用凱氏定氮法檢測樣品中的含氮量，利用轉(zhuǎn)換因子6.38（酪蛋白）計算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。糖基化酪蛋白中的蛋白質(zhì)含量為：凱氏定氮法測出的樣品中總氮量減去導入氨基葡萄糖所帶入的氮含量，再乘以轉(zhuǎn)換因子（6.38）。

1.3.5 必需氨基酸組成分析

樣品酸水解后利用L-8800型氨基酸自動分析儀，按照設備操作說明書分析必需氨基酸含量。

1.3.6 糖基化酪蛋白的體外消化及水解動力學模型

糖基化酪蛋白的體外消化根據(jù)Tang Chuanhe等[18]的方法進行，并稍作修改。

1.3.6.1 胃蛋白酶水解

糖基化酪蛋白溶于去離子水中（50 g/L），調(diào)整溶液pH 1.9，加入胃蛋白酶（占蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)2%），37 ℃水解60 min；分別在0、10、20、30、40、50、60 min檢測消化物的DH和TCA-SN，反應結束后迅速調(diào)整溶液pH 7，凍干。

1.3.6.2 胰蛋白酶水解

糖基化酪蛋白的胃蛋白酶水解物復溶于去離子水中（50 g/L），加入胰蛋白酶（占蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)6%），37 ℃水解120 min；分別在0、15、30、45、60、90、120 min時取樣，沸水浴滅酶10 min后檢測該時間點消化物的DH和TCA-SN。水解結束后沸水浴滅酶，調(diào)整水解物pH 7，凍干用于后續(xù)實驗。酪蛋白同樣水解處理。

1.3.6.3 糖基化酪蛋白水解程度的測定

參照趙新淮等[19]的方法計算蛋白質(zhì)的DH，計算公式如下：

式中：6.38為酪蛋白的轉(zhuǎn)換因子；8.2為每克酪蛋白中肽鍵總物質(zhì)的量（mmol/g）；M為待測樣品水解前即存在的游離氨基含量，酪蛋白此值為0.57 mmol/g，糖基化酪蛋白此值為0.52 mmol/g。

參照Gauthier等[20]的方法進行TCA-SN測定。通過凱氏定氮法測得不同水解程度下樣品中的總氮含量；取蛋白樣品1∶1和質(zhì)量分數(shù)20%的TCA溶液混合，充分振蕩后10 000×g離心15 min，凱氏定氮法測定上清液中的氮含量。TCA-SN計算公式如下：

沒有經(jīng)過水解的蛋白樣品利用TCA同樣處理，其上清液中的氮含量作為空白扣除。

1.3.7 水解動力學分析

1.3.7.1 初始底物質(zhì)量濃度對水解反應的影響

制備糖基化酪蛋白的胃蛋白酶水解物（水解時間60 min）。調(diào)整底物質(zhì)量濃度至20、40、60、80 g/L，固定初始胰蛋白酶質(zhì)量濃度為1.5 g/L，37 ℃條件下進行水解反應，分別反應0、30、60、90、120 min，測定得到DH隨時間變化曲線。

1.3.7.2 初始酶質(zhì)量濃度對水解反應的影響

制備兩類糖基化酪蛋白的胃蛋白酶水解物（水解時間60 min），固定底物質(zhì)量濃度為60 g/L。調(diào)整胰蛋白酶質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、2.0 g/L，在37 ℃條件下進行水解反應，分別反應0、30、60、90、120 min，測定得到DH隨時間變化曲線。

根據(jù)DH隨時間的變化數(shù)據(jù)，利用1stOpt軟件非線性回歸擬合水解動力學方程。

1.3.8 兩類糖基化酪蛋白消化物中的肽分子質(zhì)量分布分析

糖基化酪蛋白消化物中的肽分子質(zhì)量分布參照李暢[21]的方法進行分析。氧化型谷胱甘肽（612.6 Da）和天冬氨酸（133.1 Da）用作標準分子物質(zhì)。

調(diào)整消化物質(zhì)量濃度為50 g/L，上樣量180 μL；去離子水洗脫，流速為0.3 mL/min；檢測波長為215 nm和280 nm。分析各消化物紫外吸收強度隨時間的變化趨勢，根據(jù)標準分子物質(zhì)的出峰時間計算消化物中肽分子質(zhì)量的大致分布情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均為3 次獨立重復實驗的平均值；差異顯著性分析使用SPSS 16.0軟件進行，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義；采用Excel 2010、Adobe Photoshop CS 5軟件繪制圖示；用1stOpt進行非線性擬合。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白糖基化的SDS-PAGE驗證

圖1 酪蛋白及糖基化酪蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profiles of glycosylated and native caseinate stained for both protein and saccharide

由圖1A可以看出，與酪蛋白（泳道1）相比，糖基化酪蛋白（泳道2）的α、β亞基譜帶明顯減少，而在分離膠頂端有明顯的新譜帶出現(xiàn)，表明有大分子的蛋白質(zhì)共聚物生成。由圖2B可以看出，在分離膠頂端出現(xiàn)大分子蛋白質(zhì)聚合物的位置，出現(xiàn)了新條帶，該條帶具有明顯的糖染色現(xiàn)象，表明糖基化酪蛋白中含有糖基。SDSPAGE表明，TGase催化酪蛋白與殼寡糖發(fā)生了糖基化反應，生成了大分子的糖蛋白共聚物。這直接證實了TGase催化殼寡糖連接到酪蛋白分子中。

美拉德反應途徑糖基化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析也有相似的譜圖特征。Koch等[22]利用SDS-PAGE蛋白染色和糖染色實驗，證實了乳清蛋白-柑橘膠美拉德反應產(chǎn)物中有糖蛋白的生成。Spotti等[23]研究了乳清蛋白-葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)修飾產(chǎn)物呈現(xiàn)出特異的蛋白染色和糖染色現(xiàn)象，且膠片上的條帶呈現(xiàn)連續(xù)發(fā)散狀，表明美拉德反應過程中有不同分子質(zhì)量的糖基化交聯(lián)產(chǎn)物生成。

2.2 氨基葡萄糖的導入量

2.2.1 氨基葡萄糖的標準曲線

利用RP-HPLC測定不同質(zhì)量濃度氨基葡萄糖溶液對應的峰面積，可發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖質(zhì)量濃度（x）與所測峰面積（y）呈線性關系，方程為：y=999 904x-59 368（R2=0.999 3）。線性關系良好，可以用于計算糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖的導入量。

2.2.2 TGase途徑糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖的導入量

圖2 氨基葡萄糖標準溶液（A）和糖基化酪蛋白水解物（B）的RP-HPLC分析譜圖Fig. 2RP-HPLC pro fi les of OPA-derivatized glucosamine in standard solution (A) and glycosylated caseinate (B)

本研究采用RP-HPLC外標定量法對糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖的導入量進行定量分析，以每千克酪蛋白中導入的氨基葡萄糖質(zhì)量表示TGase催化的酪蛋白糖基化程度。由圖2A可以看出，氨基葡萄糖標準品在4.6 min左右處出現(xiàn)峰1。在圖2B中，殼寡糖糖基化酪蛋白的水解物也在4.6 min時出現(xiàn)了峰1，表明在該水解物中存在和氨基葡萄糖標準品水解物相同的組分，即糖基化酪蛋白中有氨基葡萄糖的存在。Jiang Shujuan等[24]率先利用RP-HPLC法分析了TGase途徑糖基化大豆分離蛋白中氨基葡萄糖的導入量，發(fā)現(xiàn)1 mol大豆分離蛋白可以和3.3 mol的氨基葡萄糖共價交聯(lián)。Wang Xiaojie等[3]利用TGase將氨基葡萄糖導入到了玉米醇溶蛋白中，1 g玉米蛋白可以結合97.48 mg氨基葡萄糖。本研究發(fā)現(xiàn)，TGase成功將殼寡糖連接到酪蛋白分子上，產(chǎn)物中氨基葡萄糖的導入量為6.86 g/kg酪蛋白。RP-HPLC分析結果進一步證實SDS-PAGE分析結論：在TGase催化作用下，殼寡糖和酪蛋白共價結合，生成殼寡糖糖基化酪蛋白，該修飾產(chǎn)物是一種糖蛋白。

2.3 糖基化修飾反應對酪蛋白的體外消化性的影響

2.3.1 胃蛋白酶水解

圖3 酪蛋白及糖基化酪蛋白的胃蛋白酶水解曲線Fig. 3 TCA-SN and degree of hydrolysis of native and glycosylated casein via pepsin

由圖3可知，隨著水解時間的延長，糖基化酪蛋白和酪蛋白的水解程度逐漸上升，糖基化酪蛋白的胃蛋白酶消化能力低于酪蛋白。經(jīng)胃蛋白酶水解60 min后，酪蛋白和糖基化酪蛋白的TCA-SN分別提高了6.73%和6.22%；當以DH為評價指標時，酪蛋白和糖基化酪蛋白的DH分別增加2.02%和1.93%。DH和TCA-SN分析結果均表明，糖基化酪蛋白的胃蛋白酶水解能力低于酪蛋白。

TGase途徑糖基化修飾反應中，TGase在催化蛋白質(zhì)和氨基糖共價結合的同時，還能夠催化蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)反應，形成ε-γ-谷氨?；?賴氨酸異肽鍵。新形成的異肽鍵降低了肽鏈的柔性，使蛋白質(zhì)分子結構更加的致密，疏水性氨基酸的數(shù)量減少，暴露程度降低，導致胃蛋白酶消化能力下降[25]。與此同時，糖基化反應所引入的糖基又會使得蛋白質(zhì)親水性增加，分子結構部分伸展，這有利于蛋白質(zhì)水解[26]。本研究中，在兩種因素的共同作用下，糖基化酪蛋白的胃蛋白酶消化能力稍低于酪蛋白。

2.3.2 胰蛋白酶進一步水解

利用胰蛋白酶對糖基化酪蛋白的胃蛋白酶水解物進一步水解，結果如圖4所示，兩種水解物的DH隨時間的延長持續(xù)增加，反應前15 min DH增加較快，隨后反應速度放緩。經(jīng)胰蛋白酶水解后，酪蛋白胃蛋白酶消化物的TCA-SN（圖4A）從6.73%增加到41.88%，糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的TCA-SN從6.22%增加到38.74%；以DH為評價指標（圖4B），在120 min的水解時間內(nèi)，酪蛋白胃蛋白酶消化物的DH從2.02%增加到14.57%，糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的DH從1.93%增加到13.76%。這些結果表明，胰蛋白酶對兩種蛋白質(zhì)的水解作用效果強于胃蛋白酶；糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的胰蛋白酶消化性低于酪蛋白的胃蛋白酶消化物。

圖4 酪蛋白及糖基化酪蛋白的胰蛋白酶水解曲線Fig. 4 TCA-SN and degree of hydrolysis of glycosylated and native casein via typsin

在TGase途徑糖基化修飾反應中，賴氨酸殘基參與分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，新形成的異肽鍵中賴氨酸殘基的分子構象發(fā)生改變，無法被胰蛋白酶識別；此外，交聯(lián)反應形成的大分子聚合物使蛋白質(zhì)分子結構更加密，進一步降低了胰蛋白酶的作用效果[27]。而糖基的導入會使被修飾產(chǎn)物的親水性增加，蛋白質(zhì)結構松散，有利于胰蛋白酶作用，付淼[28]發(fā)現(xiàn)殼寡糖的導入量（占蛋白質(zhì)含量）為12.8 g/kg時，糖基化大豆分離蛋白的體外消化能力尚低于大豆分離蛋白，而當殼寡糖的導入量增加到30.8 g/kg時，修飾產(chǎn)物的體外消化能力高于大豆分離蛋白。

2.4 水解動力學模型的建立

糖基化酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后水解程度太低（60 min后DH仍小于2%），且實驗誤差較大，故本研究僅分析了胰蛋白酶對糖基化酪蛋白胃蛋白酶水解物的水解動力學曲線，并建立該過程的水解動力學模型。

2.4.1 水解動力學模型建立

根據(jù)前人的研究結果[29]，水解酶限制性水解蛋白質(zhì)符合如下模型：

式中：a、b為DH動力學常數(shù)；k2為反應速率常數(shù)；e0、s0分別為初始酶質(zhì)量濃度/（g/L）和初始底物質(zhì)量濃度/（g/L）；c為常數(shù)。

圖5 初始底物質(zhì)量濃度（A）及初始酶質(zhì)量濃度（B）對DH的影響Fig. 5 Effect of initial enzyme (A) and substrate concentrations (B) on degree of hydrolysis

根據(jù)圖5結果，利用1stOpt軟件非線性回歸擬合動力學參數(shù)a、b的值。由表1可知，動力學參數(shù)a隨著初始底物質(zhì)量濃度（s0）的增加而減小，隨著蛋白酶初始質(zhì)量濃度（e0）的增加而增大，而動力學參數(shù)b接近一個常數(shù)，本實驗中b值取平均數(shù)0.42。

表1 不同水解條件下非線性回歸擬合動力學參數(shù)Table 1 Estimated parameters using non-linear regression under different hydrolysis conditions

根據(jù)式（2）可知，在恒溫水解反應過程中，a值與e0/s0呈線性關系。由圖6可得：

結合式（3）計算得出：k2=58.794，c=3.73×10-3，即在胰蛋白酶水解糖基化酪蛋白胃蛋白酶水解物的反應速率常數(shù)k2為58.79 min-1。將動力學參數(shù)代入式（3）的方程，則該反應的水解動力學模型為：

圖6 動力學參數(shù)a隨e0/s0的變化趨勢Fig. 6 Variation in kinetic parameter a at different e0/s0 levels

從式（6）可以看出，糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的DH隨著反應時間的延長而增加，初始蛋白酶濃度的增加會增加水解程度，而初始底物濃度的增加則會導致其DH的降低。

2.4.2 水解動力學模型驗證

表2 水解動力學模型的驗證Table 2 Validation of tryptic hydrolysis of the peptic digest of glycosylated casein

利用動力學模型計算出的數(shù)據(jù)與實際水解測量結果進行對比，可以驗證模型的適用性。將圖5B中實際檢測的胰蛋白酶水解數(shù)據(jù)（扣除胃蛋白酶水解產(chǎn)生的DH），和水解動力學方程（3）～（6）計算出的結果相比對（表2），實測值和模型計算DH的平均相對誤差為4.4%，動力學模型計算結果與實測DH結果吻合度較好。因此，該動力學模型可以用來評價糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的胰蛋白酶的水解過程。

2.5 糖基化酪蛋白消化物的肽分子質(zhì)量分布

本研究利用凝膠過濾色譜（Sephadex G-25）對糖基化酪蛋白及酪蛋白消化物中的肽分子質(zhì)量分布情況進行了初步分析。結合標準分子質(zhì)量物質(zhì)的出峰時間，兩種消化物的肽分子質(zhì)量分布情況如表3所示，糖基化酪蛋白消化物含有較多的大分子物質(zhì)（≥612.6 Da）。TGase對蛋白質(zhì)進行糖基化修飾的同時，也催化蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián)反應，生成大分子的聚合物，以及糖與蛋白質(zhì)的交聯(lián)產(chǎn)物[30]。交聯(lián)反應改變了蛋白質(zhì)的結構，影響了消化酶的識別位點，修飾產(chǎn)物的消化性降低，體外模擬消化后形成了較大分子質(zhì)量的肽段。其他研究也有類似結論，Romano等[31]發(fā)現(xiàn)在TGase作用下，白豆粉蛋白質(zhì)交聯(lián)生成新的異肽鍵，所形成的大分子聚合物結構更加致密，體外消化性降低，消化產(chǎn)物中大分子質(zhì)量物質(zhì)的含量明顯高于對照物。

表3 酪蛋白及糖基化酪蛋白消化物的肽分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular mass distribution of the digests of native and glycosylated casein

3 結 論

本實驗通過SDS-PAGE和RP-HPLC分析，證實TGase能夠催化酪蛋白和殼寡糖發(fā)生糖基化交聯(lián)修飾反應，修飾產(chǎn)物為糖基化酪蛋白；體外模擬消化結果表明，糖基化修飾反應對酪蛋白的消化性產(chǎn)生了一定不利影響；糖基化酪蛋白水解物中更多大分子質(zhì)量肽段的存在，進一步證實了糖基化修飾反應對酪蛋白消化性的抑制作用。本研究可為TGase途徑蛋白質(zhì)糖基化修飾技術的工業(yè)化應用提供理論支持和技術參考。