唐佳代，邱樹毅，王春曉，吳鑫穎

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

小曲是以大米、米糠、麩皮等為原料，用于釀造生產(chǎn)甜米酒、黃酒、米香型、清香型和豉香型白酒的糖化發(fā)酵劑，根據(jù)形態(tài)不同可以分為塊狀小曲和散曲等[1-3]。小曲中微生物的群落組成和代謝決定了小曲酒的風(fēng)味與品質(zhì)，細(xì)菌在小曲中起著至關(guān)重要的作用，在發(fā)酵初期提供釀造所需的酸性環(huán)境，產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等豐富多樣的酶系，且具有酯化、促美拉德反應(yīng)和產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)等能力，從而促進(jìn)酒中多種風(fēng)味物質(zhì)的形成[4-9]。探究小曲中細(xì)菌多樣性，以此為基礎(chǔ)，研究釀酒小曲功能細(xì)菌并應(yīng)用于釀酒是目前提高酒質(zhì)和生產(chǎn)效率的手段之一。

早期關(guān)于酒曲中細(xì)菌多樣性的研究主要采用傳統(tǒng)的分離純化方法，該方法雖工作量大、分析速度慢[5-6]，只能獲得可培養(yǎng)微生物的部分信息，對(duì)于菌群結(jié)構(gòu)的分析具有片面性，但獲得可培養(yǎng)微生物的生物學(xué)形態(tài)特征及生理生化性能對(duì)于功能細(xì)菌的篩選具有重要意義。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）和高通量測(cè)序技術(shù)被應(yīng)用于分析酒曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)。PCR-DGGE技術(shù)成本較低，但操作過程繁瑣，對(duì)技術(shù)人員要求較高，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)大量樣本的同時(shí)檢測(cè)[10]。高通量測(cè)序技術(shù)安全性和可靠性高，能更為全面的表現(xiàn)樣品微生物豐度等優(yōu)勢(shì)[11]。因此，近幾年，高通量測(cè)序技術(shù)開始應(yīng)用于小曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析[6，12-15]。胡翠翠[14]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了黃酒曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群，結(jié)果表明，黃酒曲中主要細(xì)菌菌群包括片球菌屬（Pediococcus）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、桿菌屬（Geobacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、鏈球菌屬（Streptococcus）、醋桿菌屬（Acetobacter）等20個(gè)屬；WU H等[12]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了中國(guó)華西、湖北、四川釀酒小曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，共鑒定出17種細(xì)菌，其中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）；WANG J等[13]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了中國(guó)華西、湖北、四川傳統(tǒng)小曲中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，小曲中的細(xì)菌主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、Pediococcus、Weissella、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Acetobacter、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和葡糖桿菌屬（Gluconobacter）。

本研究首次采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離方法對(duì)貴州5個(gè)地區(qū)（黔南州、遵義、盤州、威寧、興仁）代表性傳統(tǒng)釀酒小曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)不同小曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行分析，挖掘具有地域特色的功能細(xì)菌資源，以期為進(jìn)一步利用和開發(fā)小曲微生物資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

小曲A：貴州威寧縣某酒廠生產(chǎn)塊狀釀酒小曲；小曲B：貴州盤州市某酒廠生產(chǎn)塊狀釀酒小曲；小曲C：貴州遵義市某酒廠生產(chǎn)塊狀釀酒小曲；小曲D：貴州黔南州某酒廠生產(chǎn)釀酒散曲；小曲E和F：貴州興仁市生產(chǎn)塊狀釀酒小曲。采集時(shí)間為2017年9月份，取樣后分別裝入密封袋，置于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，分2份后分別保藏于4 ℃和-80 ℃。

1.1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；丙三醇（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；瓊脂糖H（生化試劑）：上海斯信生物科技有限公司；Loading Buffer：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31RBSFA顯微鏡：日本東京奧林巴斯株式會(huì)社；SPX-250生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜：青島海爾股份有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；5424EQ766751離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Block assembiy 96G PCR儀：德國(guó)Jena分析儀器設(shè)備股份有限公司；Bio-Bset140E 凝膠成像儀：美國(guó)西蒙國(guó)際公司。

1.3 方法

1.3.1 小曲中DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

將保藏于-80 ℃的小曲樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序。具體操作：采用土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒提取小曲樣品中的DNA，以其為模板對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3與V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物為F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR擴(kuò)增體系為引物F、R各1.5μL，基因組DNA 5 μL，KOD FX Neo 1 μL，buffer 25 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）10 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)至總體系50 μL。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共15個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用1.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)質(zhì)DNA片段進(jìn)一步在Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)條件下進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測(cè)序所得序列通過拼接、過濾、去除嵌合體，得到最終有效序列。利用定量洞察微生物生態(tài)學(xué)（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），將相似度＞97%的序列定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一種代表序列，并基于Silva分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì)，進(jìn)行分類學(xué)注釋。使用Mothur（version v.1.30）軟件在97%相似度水平下對(duì)樣品的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，Alpha多樣性指數(shù)衡量指標(biāo)包括超1（Chao1）、ACE、香農(nóng)（Shannon）和辛普森（Simpson）指數(shù)[16]。采用R軟件繪制相對(duì)豐度熱圖，并在屬水平上進(jìn)行熱圖聚類分析。采用PCA對(duì)不同小曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行分析。

1.3.3 傳統(tǒng)小曲中細(xì)菌的分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定

分別稱取10 g傳統(tǒng)小曲于250 mL三角瓶中，加入無(wú)菌水至終體積100 mL，加入玻璃珠后用透氣膜封口；室溫條件下150 r/min振蕩20 min；靜置后，取1 mL上清液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，將梯度稀釋液分別涂布于NA培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)1～2 d。待菌落長(zhǎng)出后，計(jì)數(shù)，挑出單菌落在NA培養(yǎng)基上分離純化3～4次，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小曲細(xì)菌多樣性分析

6種小曲樣品的16S rRNA V3和V4區(qū)高通量測(cè)序結(jié)果經(jīng)過濾和雙端拼接后，共得到369 734條優(yōu)質(zhì)序列，優(yōu)質(zhì)序列去除嵌合體后共得到365 169條有效序列，平均堿基長(zhǎng)度為423 bp，得到2 181個(gè)OTU。為直觀展現(xiàn)各小曲樣品中的共有OTU和特有OTU，對(duì)所有小曲樣品的OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和比較[17]，結(jié)果見圖1。由圖1可知，6種小曲樣品中共有的OTU數(shù)為65個(gè)。使用Greengenes細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，共注釋得到209個(gè)門、475個(gè)綱、750個(gè)目、1 269個(gè)科、2 049個(gè)屬和1 458個(gè)種水平的細(xì)菌。

圖1 6種小曲樣品OTU的統(tǒng)計(jì)和比較Fig.1 Statistics and comparison of OTU of 6 kinds of Xiaoqu samples

從6種小曲樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列所代表的OTU數(shù)目，并以序列數(shù)與OTU數(shù)構(gòu)建稀釋性曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，小曲樣品A、B、C、D、E、F的稀釋性曲線先急劇上升，隨著測(cè)序序列數(shù)的增加后趨于平緩，說明在序列數(shù)增加前期細(xì)菌群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)；當(dāng)序列數(shù)＞20 000個(gè)后，物種不再隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多；結(jié)果表明，6種小曲樣本測(cè)序量充分，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映小曲細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

圖2 6種小曲樣品細(xì)菌OTU數(shù)稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial OTU numbers in 6 kinds of Xiaoqu samples

利用Mothur軟件繪制Shannon指數(shù)曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，所有小曲樣品的Shannon指數(shù)曲線都隨著測(cè)序序列數(shù)的增加趨于平滑，結(jié)果表明測(cè)序數(shù)據(jù)量充分，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映小曲細(xì)菌的物種信息。

使用Mothur軟件評(píng)估6種小曲樣品細(xì)菌的Alpha多樣性。在97%相似度水平下，各小曲樣品Alpha多樣性指數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，Coverage數(shù)值越大表示樣本檢出率越高，6種小曲樣品的Coverage數(shù)值均＞0.997，說明樣本中物種被測(cè)出的概率較高，測(cè)序的結(jié)果能夠真實(shí)的反映樣品物種豐度及多樣性[18-19]。小曲D的Simpson指數(shù)最低，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于塊狀小曲，說明散曲物種分布均勻性最佳，物種豐富度及多樣性均高于塊狀小曲。5種塊狀小曲樣品中物種多樣性由高至低依次為小曲E＞小曲B＞小曲F＞小曲A＞小曲C，而塊狀小曲中物種豐富度由高至低依次為小曲A＞小曲B＞小曲E＞小曲F＞小曲C。

圖3 6種小曲樣品細(xì)菌Shannon指數(shù)曲線Fig.3 Shannon index curve of bacteria in 6 kinds of Xiaoqu samples

表1 6種小曲樣品細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of bacterial Alpha diversity index of 6 kinds of Xiaoqu samples

2.2 小曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于屬水平小曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平，對(duì)貴州6種小曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4，圖4中顯示豐度水平前十的物種，其他物種合并為Others。由圖4可知，在6種小曲樣品中主要含有的細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。各小曲樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬不同：小曲A中為Bacillus（55.04%）和Enterobacter（5.46%），小曲B中為Enterobacter（23.90%）、歐文氏菌屬（Erwinia）（18.15%）、Bacillus（17.32%）和Pediococcus（11.36%），小曲C 中為L(zhǎng)actobacillus（66.54%）和Pediococcus（4.67%），小曲D中為Bacillus（6.42%）、Lactobacillus（2.95%）和乳球菌屬（Lactococcus）（1.14%），小曲E中為Acinetobacter（10.33%）、Pediococcus（10.23%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（6.86%）和Lactococcus（5.12%），小曲F中為Pediococcus（37.88%）。

圖4 基于屬水平6種小曲樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Bacterial community structure of 6 kinds of Xiaoqu samples based on genus level

2.2.2 基于種水平小曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于種水平對(duì)貴州6種小曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，6種小曲樣品中均有大量的細(xì)菌無(wú)法在種水平上鑒別（樣品C、D、E、F中＞90%的細(xì)菌無(wú)法給出種水平的OTU），說明貴州傳統(tǒng)小曲中具有豐富的細(xì)菌資源尚未被開發(fā)，沒有列入高通量測(cè)序所使用的Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)中。在高通量測(cè)序能夠鑒別至種水平的細(xì)菌中，樣品A中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），占58.46%；樣品B中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Enterobacter cowanii和熱淀粉芽孢桿菌（Bacillus thermoamylovorans），分別占46.12%和13.35%；樣品C中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），占4.91%；樣品D中鑒定出細(xì)菌較少，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Cetobacterium somerae，僅占3.80%；樣品E和F中能夠鑒定至種水平的細(xì)菌豐度均＜1%。

圖5 基于種水平6種小曲樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Bacterial community structure of 6 kinds of Xiaoqu samples based on species level

2.3 基于屬水平物種豐度聚類熱圖分析

與柱狀圖相比，相對(duì)豐度熱圖能更加直觀的反映出樣本間細(xì)菌群落多樣性的異同，相對(duì)豐度熱圖通過顏色梯度及相似程度來(lái)反映樣品群落結(jié)構(gòu)的相似性[20]。基于屬水平，6種小曲樣品物種豐度聚類熱圖見圖6。由圖6可知，散曲D中多個(gè)物種豐度較高，小曲A中Bacillus豐度最高，小曲B中Enterobacter、Erwinia等5個(gè)物種豐度較高，小曲C中Lac-tobacillus和Weissella豐度較高，小曲E中Acinetobacter、Leuconostoc和Lactococcus等6個(gè)物種豐度較高，小曲F中Pedio coccus豐度最高。橫向聚類結(jié)果顯示小曲C與小曲F、小曲A與小曲B間物種豐度相似度較高，散曲D與傳統(tǒng)小曲間物種豐度相似度低。

圖6 基于屬水平6種小曲樣品物種豐度聚類熱圖Fig.6 Heatmap of species abundance clustering of 6 kinds of Xiaoqu samples based on genus level

熱圖中顏色代表物種豐度；縱向表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況，兩物種間距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明兩個(gè)物種在各樣品間的豐度越相似；橫向表示不同樣品的各物種豐度的相似情況，兩樣品間距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明這兩個(gè)樣品的各物種豐度越相似。

2.4 基于屬水平主成分分析

基于屬水平對(duì)6種小曲樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖7。由圖7可知，細(xì)菌第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為48.14%、26.99%，兩個(gè)主要成分能夠解釋75.13%的物種差異。因此，采用PC1、PC2對(duì)6種小曲樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行PCA是可行的。小曲樣品A、B和D之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，樣品E和F之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，樣品C與其他5個(gè)小曲樣品明顯分離，說明樣品C與其他5個(gè)樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上有較大差異。

圖7 基于屬水平6種小曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.7 Principal component analysis of bacterial community structure of 6 kinds of Xiaoqu samples based on genus level

2.5 小曲中細(xì)菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離方法測(cè)定得到A、B、C、E、F 5種傳統(tǒng)塊狀小曲樣品中的細(xì)菌菌落總數(shù)分別為9.21×107CFU/g、1.15×107CFU/g、6.93×106CFU/g、1.17×106CFU/g和2.77×106CFU/g；小曲樣品A中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)最多，小曲樣品B次之，小曲樣品E最少。通過分離純化，共得到84株細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)分類，A、B、C、E和F 5種傳統(tǒng)塊狀小曲中分離得到的細(xì)菌種類分別為5種、8種、2種、9種和6種。分離優(yōu)勢(shì)菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見表2。由表2可知，從小曲A、B、C中分離到的細(xì)菌主要為桿菌，而小曲E和F中分離出主要為球菌。

表2 傳統(tǒng)小曲中分離主要細(xì)菌的形態(tài)Table 2 Morphology of main bacteria isolated from traditional Xiaoqu

3 結(jié)論

該研究首次運(yùn)用高通量測(cè)序法結(jié)合可培養(yǎng)分離法全面研究貴州地區(qū)小曲中細(xì)菌的多樣性。結(jié)果表明，散曲細(xì)菌多樣性及豐富度高于塊狀小曲，且塊狀小曲C最低；小曲A、B和D及E和F之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似；貴州地區(qū)釀酒小曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為芽孢桿菌（Bacillus）、腸桿菌（Enterobacter）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）和不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）。通過傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離方法從5種傳統(tǒng)塊狀小曲中共分離得到84株細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)觀察，A、B、C、E和F 5種傳統(tǒng)小曲中分離得到的細(xì)菌分別為5種、8種、2種、9種和6種，為貴州小曲中功能細(xì)菌的研究應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。