孫 海，張淋淋，金 橋，李 樂，左湘煕，呂 林，張亞玉

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

磷是植物生長的必需元素之一，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的養(yǎng)分限制因子[1]。土壤中磷以有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)兩種形式存在。最常見的原生磷礦物為磷灰石，次生磷礦石包括各種磷酸鈣和非晶態(tài)鋁和鐵的磷酸鹽[2]。土壤有機(jī)磷主要是正磷酸鹽單酯，包括肌醇磷酸鹽、正磷酸鹽二酯、有機(jī)聚磷酸鹽和磷酸酯[3]。成土過程中巖石及不同形態(tài)磷的相對(duì)比例發(fā)生改變，主要體現(xiàn)在磷酸鈣的減少，有機(jī)磷、非封閉磷 (表面磷)和封閉磷 (次生礦物磷)的逐漸積累[4]。研究發(fā)現(xiàn)微生物量磷在總磷含量中占比高達(dá)40%，由此可見，研究微生物解磷作用對(duì)于提高土壤中磷的利用率至關(guān)重要[5]。

土壤中磷(有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài))的生物有效性不僅與土壤中全磷含量有關(guān)，與其有效性更有關(guān)，在一定條件下二者相互轉(zhuǎn)化，其中微生物在磷的活化和固化中起著推動(dòng)作用[6]。土壤中磷的生態(tài)循環(huán)轉(zhuǎn)化過程，包括吸附-解吸、礦化-固化及無機(jī)磷形態(tài)轉(zhuǎn)化過程，土壤微生物主要參加土壤磷的礦化-固化過程，參與土壤無機(jī)態(tài)磷和有機(jī)態(tài)磷之間的互相轉(zhuǎn)變，而解磷微生物代謝產(chǎn)生的磷酸酶、根系分泌物等在此過程起催化作用。鑒于解磷微生物良好的促生效果，越來越多的工作者聚焦在解磷菌株的篩選上，目前解磷微生物包括根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、固氮螺旋菌屬及固氮菌屬等微生物[7-11]。

土壤磷循環(huán)以微生物活動(dòng)為中心，有機(jī)磷在微生物的作用下轉(zhuǎn)變成無機(jī)磷形態(tài)才能被植物吸收利用，這一過程取決于解磷微生物(Phosphate solubilizing microorganisms，PSMs) 的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量以及磷酸酶的活性[12]。假單胞菌屬是解磷微生物之一，能夠明顯提高土壤中可溶性磷的含量，增加植物對(duì)磷元素的吸收，從而促進(jìn)植物的生長[13-15]。微生物解磷機(jī)理主要包括以下三方面：一是微生物之所以能夠溶解難溶性磷酸鹽， 主要是由于其在代謝過程中分泌多種有機(jī)酸，一方面降低了培養(yǎng)介質(zhì)的pH，另一方面有機(jī)酸與Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等離子螯合而使難溶性磷酸鹽溶解[16]；二是微生物的解磷作用主要是由于在其代謝過程中分泌質(zhì)子的緣故，使培養(yǎng)介質(zhì)的酸度提高，即介質(zhì)的pH降低，從而使磷礦粉溶解[17]；三是解磷微生物在以難溶的無機(jī)磷為磷源的培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)過程中隨著有效磷含量的降低和有機(jī)酸的形成，培養(yǎng)基中形成了新的難溶性有機(jī)磷。由于有效磷的缺乏迫使微生物進(jìn)一步利用有機(jī)磷，這一動(dòng)態(tài)過程中有機(jī)磷和pH發(fā)生多次變化，直至由于營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致微生物死亡[18]。

筆者前期分離得到一株假單胞菌，經(jīng)鑒定是一株新的菌株(PseudomonasP1)，進(jìn)一步在人參上開展盆栽促生試驗(yàn)，不僅可以提高人參株高、增加須根數(shù)量，同時(shí)能夠提高人參皂苷含量，促生效果明顯[19]。但是，假單胞菌繁育過程中代謝產(chǎn)物是什么？其解磷機(jī)理目前尚不清楚，而非靶向代謝組學(xué)是對(duì)生物體小分子(相對(duì)分子量小于1000)進(jìn)行定性和半定量分析的組學(xué)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)樣本小分子代謝物的初步篩選[20]。鑒于此，本研究擬在已有研究的基礎(chǔ)上，利用液體搖瓶方式進(jìn)一步開展假單胞菌胞外代謝物非靶向代謝組學(xué)研究，挖掘與無機(jī)磷R(shí)P(Rock phosphate)分解相關(guān)差異代謝物，為該微生物溶磷機(jī)理研究及推進(jìn)微生物肥料開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 假單胞菌PseudomonasP1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所從野山參根區(qū)土壤分離得到，保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC60363)。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L， pH 7.2～7.4；無機(jī)磷液體培養(yǎng)基( 以下簡記為PKO 培養(yǎng)基) : 葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g， Ca3(PO4)23 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g， MnSO4·4H2O 0.03 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.1.3 胞外代謝物準(zhǔn)備 利用無機(jī)磷培養(yǎng)基對(duì)活化后的P1菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)，利用平板稀釋涂布法培養(yǎng)計(jì)數(shù)，最后篩選得到菌液濃度為 2.0×106～20.0×106cfu/mL的6瓶菌懸液作為目標(biāo)代謝物， 4 ℃、3 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，重復(fù)3次后，過0.22 μm微孔濾膜過濾。部分將上清液轉(zhuǎn)入2 mL凍存管并在-80 ℃冰箱保存，作為處理組供試樣品，另一部分用于有效磷的測(cè)定(24 h內(nèi)測(cè)定)。

1.2 分析方法

1.2.1 代謝組學(xué)檢測(cè) 分析取等量細(xì)胞樣品加入400 μL冷甲醇[V(甲醇)∶V(水)=4∶1]，低溫下高通量組織破碎儀破碎，加入100 μL超純水，旋渦混勻后，冰上超聲10 min，3次。4 ℃、 12 000 r/min 離心15 min，取上清液抽干，加V(乙腈)∶V(水)=1∶1 100 μL復(fù)溶，利用AB SCIEX公司的超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-TripleTOF MS)進(jìn)行檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為BEHC18柱(100 mm×2.1 mm，內(nèi)徑1.7 μm；Waters，Milford，USA)；流動(dòng)相A為水(含φ=0.1%甲醇)，流動(dòng)相B為V(乙腈)∶V(異丙醇)=1∶1，異丙醇含φ= 0.1%甲酸；流速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式，電噴霧毛細(xì)管電壓，進(jìn)樣電壓和碰撞電壓分別為：1.0 kV、40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為：120 ℃和500 ℃，載氣流量為900 L/h，質(zhì)譜掃描范圍50～1 000m/z，分辨率為30 000。

質(zhì)控：為了評(píng)價(jià)在上機(jī)過程中分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，試驗(yàn)過程中會(huì)繪制一個(gè)質(zhì)控(Quality control，QC)樣品。QC樣品由所有檢測(cè)樣品混合而成，在一起分析的過程中，每6個(gè)分析樣品插入一個(gè)QC樣品，在樣品分析時(shí)，可通過QC樣本的重復(fù)性以考察整個(gè)分析過程中儀器穩(wěn)定性，同時(shí)也可用于發(fā)現(xiàn)在分析系統(tǒng)中變異大的變量，保證結(jié)果的可靠性。

1.2.2 有效磷測(cè)定 取5 mL收集的胞外代謝菌懸液，按照鉬銻抗比色法測(cè)定培養(yǎng)液中的有效磷[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 LECO 公司的Chroma TOF4.3X 軟件和LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫對(duì)采集得到的譜圖進(jìn)行過濾噪音、解卷積、峰強(qiáng)度校正、峰定性和定量等分析。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，利用Simca-P v13.0軟件(Umetrics AB，Umea，Sweden)進(jìn)行正交最小偏二乘判別分析[Orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA)]、利用R 語言軟件包進(jìn)行OPLS-DA及維恩圖的分析繪制，根據(jù)變量權(quán)重重要性排序(Variable importance in projection，VIP>1)，結(jié)合t檢驗(yàn) (P<0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物；采用皮爾森相關(guān)分析，設(shè)r≥0.9，P<0.05 為相關(guān)性化合物，對(duì)差異化合物進(jìn)一步利用GraphPad Prism 5進(jìn)行柱狀圖繪制。

有效磷及差異代謝物采用Excel 2016和SAS 9.1進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效磷質(zhì)量濃度

利用液體藥瓶和鉬銻抗比色法測(cè)定P1對(duì)無機(jī)磷的溶磷效果的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以不接菌為對(duì)照(CK)，培養(yǎng)達(dá)到指數(shù)期后，對(duì)照培養(yǎng)液中可溶性磷的質(zhì)量濃度僅為4.44 μg/mL，接種P1處理可溶性磷的質(zhì)量濃度為461.36 μg/mL，是CK的103.9倍，由此表明P1菌株具有高效溶磷能力。

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果分析

2.2.1 多元統(tǒng)計(jì)分析 OPLS-DA結(jié)果如圖1，PseudomonasP1和對(duì)照組代謝產(chǎn)物分別聚為一類，明顯分離，表明處理組和對(duì)照組存在明顯差異，且樣本全部處于95% 置信區(qū)間。PLS-DA正負(fù)離子模式的模型參數(shù)分別為R2X=0.719，Q2=0.994，R2和Q2為協(xié)方差模型R2Y、Q2Y線性回歸直線與相關(guān)度的截距值，用來衡量模型是否過擬合，Q在縱軸上的截距等于或小于0，表明試驗(yàn)所建立的模型有效。總的來說，模型不存在過度擬合現(xiàn)象，穩(wěn)健性良好，結(jié)果可用于后續(xù)的差異成分分析。

圖1 Pseudomonas P1的OPLS-DA模型和置換檢驗(yàn)Fig.1 OPLS-DA model and permutation test results of Pseudomonas P1

2.2.2 潛在生物代謝物篩選 將PseudomonasP1與對(duì)照的代謝物繪制韋恩圖，尋找處理和對(duì)照差異代謝物。結(jié)果顯示PseudomonasP1代謝產(chǎn)物共有418種，對(duì)照代謝產(chǎn)物有367種，二者共有代謝產(chǎn)物為354種(圖2)。根據(jù)OPLS-DA模型獲得的特征變量VIP值，共篩選出VIP>1.0且t檢驗(yàn)P<0.05的差異代謝物共23種(表1)。并對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖3)。結(jié)果表明尿石酸B-3-O-葡糖苷酸、m-香豆酸、磷脂酰乙醇胺(18∶1(9Z)/15∶0)、磷酯酰乙醇胺(17∶1(92)/18∶0)、磷脂酰乙醇胺(16∶0/16∶1(9Z))、磷脂酰乙醇胺 (16∶1(9Z)/19∶1(9Z))、磷脂酰乙醇胺 (16∶1(9Z)/20∶1(11Z))、磷脂酰乙醇胺 (17∶0/15∶0)[U]、1-棕櫚酰-2-亞油?；字Ｒ掖及贰-(+)-3-苯基乳酸、C16鞘氨醇、磷脂酰乙醇胺 (19∶1(9Z)/0∶0)、3-O-咖啡酰莽草酸、植物鞘氨醇、鞘氨醇和磷脂酰乙醇胺共16種差異代謝物在PseudomonasP1處理組中相對(duì)含量明顯升高。而β-D-乳糖、肌醇、3-羥基-3-甲基-戊二酸、雷尼替丁、4-羥基-2-丁烯酸 γ-內(nèi)酯以、(z-4′，6-二羥基壬酮-6-葡萄糖苷及雙(2-乙基己基)領(lǐng)苯二甲酸酯共7種差異代謝物在PseudomonasP1處理組中相對(duì)含量明顯下降。

圖2 Pseudomonas P1與對(duì)照代謝物韋恩圖Fig.2 Venn diagram of differentially expressed metabolites in Pseudomonas P1 and control

表1 Pseudomonas P1與對(duì)照差異代謝物Table 1 Differentially expressed metabolites in Pseudomonas P1 and control

注：↑表示在PseudomonasP1中差異代謝物水平上升，↓表示在PseudomonasP1中差異代謝物水平下降。

Note: ↑means that the level of differentially expressed metabolites increased in P1 group，while ↓ means that the level of differentially expressed metabolites decreased in P1 group.

圖3 Pseudomonas P1與對(duì)照代謝物相對(duì)含量變化Fig.3 Relative intensity changes of the differentially expressed metabolites in Pseudomonas P1 and control

2.2.3 KEGG代謝通路分析 將處理組和對(duì)照組比較分析得到的全部差異代謝物提交至KEGG網(wǎng)站，進(jìn)行通路分析。結(jié)果顯示，PseudomonasP1與對(duì)照組之間代謝物共參與22條代謝通路，其中參與3條以上的代謝通路10條，結(jié)果見表2。其中磷脂酰乙醇胺(18∶1(9Z)/15∶0)、磷脂酰乙醇胺(16∶1(9Z)/19∶1(9Z))、磷脂酰乙醇胺(16∶1(9Z)/20∶1(11Z)) 3種代謝物共同參與10條代謝通路，肌醇參與9調(diào)代謝通路，鞘氨醇和植物鞘氨醇共同參與2條代謝通路， m-香豆酸共同參與3條代謝通路。

表2 差異代謝物代謝通路分析Table 2 Metabolic pathway of the differentially expressed metabolites in Pseudomonas P1 and control

注：√表示差異代謝物參與該代謝通道。

Note: √ means that the differentially expressed metabolite sparticipate in the metabolic pathway.

3 討 論

磷是植物生長發(fā)育過程中三大要素之一。通常土壤中磷的含量相當(dāng)高，但大部分磷是以不溶的形式存在，因此不能滿足植物的生長需要。這些不溶的磷以磷灰石的無機(jī)態(tài)形式或者以肌醇磷酸鹽、磷酸三脂等有機(jī)態(tài)存在[22]。而植物根際促生菌可以通過釋放有機(jī)酸或分泌胞外磷酸酶，溶解土壤中不溶性磷，從而使磷被有效的吸收和利用。已有研究表明在植物根圍普遍存在著能溶磷和解磷的細(xì)菌，包括固氮菌、芽孢桿菌、腸桿菌、假單胞菌、曲霉菌和青霉菌等。課題組前期研究得到一株高效溶磷菌(PseudomonasP1)，液體搖瓶試驗(yàn)表明處理組可溶性磷含量是對(duì)照的103.9倍，表明P1菌株具有良好的溶磷能力。

細(xì)胞代謝根據(jù)研究對(duì)象不同又可以分為胞內(nèi)代謝組和胞外代謝組，二者具有高度的信息互補(bǔ)性[23]，其中胞外代謝組能直接反映細(xì)胞與胞外環(huán)境間的能量物質(zhì)交換模式。P1菌株屬于假單胞菌的新種，為了揭示該菌株高效溶磷機(jī)理，本研究成功建立了P1菌株胞外代謝UPLC-Triple TOF非靶向代謝組學(xué)分析方法，科學(xué)建立模型是非靶向代謝組學(xué)后續(xù)挖掘差異代謝物的前提，而判別其是否科學(xué)通常根據(jù)OPLS-DA和Q檢驗(yàn)結(jié)果確定[24]。P1菌株的胞外OPLS-DA正負(fù)離子模式的模型有效，且Q在縱軸上截距小于0，表明模型建立不存在過度擬合，有利于進(jìn)一步對(duì)差異代謝物的識(shí)別和分析。OPLS-DA模型顯示P1與對(duì)照的代謝存在明顯差異，并篩選得到23種差異代謝物，主要包括小分子有機(jī)酸、脂類物質(zhì)、配糖體及其他物質(zhì)(表1)。

小分子有機(jī)酸主要包括尿石酸-B-3-O-葡糖苷酸、m-香豆酸、D-(+)-苯基乳酸、3-O-咖啡莽草酸，這些物質(zhì)在P1處理中相對(duì)含量顯著高于對(duì)照(圖3)，表明PseudomonasP1溶磷極有可能與這些有機(jī)酸含量有關(guān)。原因之一是這些有機(jī)酸降低培養(yǎng)基pH，增加難溶磷的溶解度[25]。另一方面能夠與培養(yǎng)液中Fe3+、Ca2+、Mg2+等離子螯合，進(jìn)而使難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷[26]。

脂類物質(zhì)主要包括磷脂酰乙醇胺、肌醇、C16-鞘氨醇、植物鞘氨醇以及鞘氨醇，其中磷脂酰乙醇胺參與多條代謝途徑(表2)，磷酸肌醇代謝途徑(Inositol phosphate metabolism)下游產(chǎn)物磷脂酰-1D-肌醇，進(jìn)一步參與糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨生物合成途徑(Glycosylphosphatidyl inositol (GPI)-anchor biosynthesis)，而磷脂酰乙醇胺則是該代謝途徑的中間產(chǎn)物，同時(shí)甘油磷脂代謝途徑(Glycerophospholipid metabolism)代謝發(fā)生變化，該途徑主要的中間產(chǎn)物是磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine)和磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine)，P1菌株處理下磷脂酰乙醇胺在這些代謝途徑中含量均高于對(duì)照，有利于細(xì)菌生存。磷脂酰乙醇胺屬于膜脂類化合物，是膜細(xì)胞的重要組成部分，在細(xì)胞功能發(fā)揮具有重要作用，包括調(diào)控細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能、蛋白質(zhì)功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[27]。同時(shí)磷脂酰乙醇胺也是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑(Glycine,serine,and threonine metabolism)下游產(chǎn)物，很可能是P1菌株在有效磷不足逆境下進(jìn)行適應(yīng)性生長和修復(fù)的一種補(bǔ)償性調(diào)節(jié)途徑[28]。此外，P1菌株細(xì)胞膜本身含有磷，主要包括核酸和磷脂等易礦化的有機(jī)磷和部分無機(jī)磷，約占微生物干物質(zhì)量的1.4%～4.7%，隨著微生物凋亡增加了可溶磷的含量。肌醇在本研究中主要參與半乳糖代謝(Galactose metabolism)和鏈霉素生物合成途徑(Streptomycin biosynthesis)，是兩條代謝途徑的中間產(chǎn)物。其中鏈霉素生物合成途徑是以葡萄糖為起始物質(zhì)，肌醇為中間產(chǎn)物，最后通過一系列代謝途徑形成鏈霉素。而本研究中P1處理下肌醇含量低于對(duì)照，原因可能是取樣時(shí)間點(diǎn)為P1培養(yǎng)指數(shù)期進(jìn)行取樣，處理組由于P1自身繁衍大量消耗葡萄糖，最終導(dǎo)致中間產(chǎn)物肌醇含量低于對(duì)照。本研究中還發(fā)現(xiàn)了其他一些差異代謝物，如4-羥基-2-丁烯酸-γ-內(nèi)酯、(z)-4′,6-二羥基壬酮-6-葡糖苷等，在P1代謝產(chǎn)物中出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，但其機(jī)理尚不明確。

4 結(jié) 論

利用液體搖瓶與鉬銻抗比色法進(jìn)一步確定PseudomonasP1菌株具有高效溶磷作用，同時(shí)利用非靶向代謝組學(xué)從整體上水平上反映P1菌株內(nèi)源性小分子代謝變化，有助于深入研究其解磷機(jī)理。初步推斷P1菌株溶磷機(jī)理由兩方面導(dǎo)致：一是由于其繁衍過程中產(chǎn)生小分子有機(jī)酸降低培養(yǎng)基中pH，促進(jìn)有效磷的溶解。二是微生物細(xì)胞膜含有磷，凋亡過程中引入培養(yǎng)基大量有機(jī)磷和無機(jī)磷，增加磷含量。通過差異代謝物和代謝通路的分析，為P1菌株溶磷機(jī)理解析提供參考和借鑒。明確微生物解磷機(jī)理還需進(jìn)一步結(jié)合差異微生物開展靶向代謝組學(xué)和驗(yàn)證試驗(yàn)，闡明P1菌株解磷機(jī)理并推進(jìn)微生物肥料開發(fā)應(yīng)用。