劉 環(huán)，王華笑，楊國平,2，張 琇,2

(1.北方民族大學 生物科學與工程學院，銀川 750021；2.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，銀川 750021)

鹽堿化屬于土地荒漠化的一種[1-3]，致使土壤肥力下降，植物根系吸水困難，嚴重影響畜牧業(yè)和農業(yè)的發(fā)展[4-5]。利用生物措施改良鹽堿地成為目前備受關注的措施之一[6-10]。近幾十年的研究顯示，在鹽脅迫環(huán)境中，植物根際促生細菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR)、AM真菌和印度梨形孢等共生菌在降低鹽害對植物影響的方面發(fā)揮著重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)施用一些改良肥料能促進植物的耐鹽堿能力[12]。雖然通過微生物與植物相互作用來增強植物的耐鹽性這一現(xiàn)象已經引起人們的關注，但迄今該類微生物菌劑產品尚屬少見，將微生物與植物聯(lián)合起來改良鹽堿土的研究更為少見。

本研究通過模擬自然鹽堿地生態(tài)，同時采用NaCl調節(jié)鹽離子濃度;Na2CO3調節(jié)pH，同時也提供鹽離子，鹽離子質量分數(shù)達到0.45%，且溶液pH達到9.0，為中度鹽堿地(pH為8.5～9.5，鹽離子質量分數(shù)為0.3%～0.6%)的標準，篩選獲得能夠提高玉米對鹽堿地抗性的菌株，并通過菌株形態(tài)結合分子生物學分析對其進行鑒定，以期為鹽堿化土壤的修復提供參考，對于中國的糧食生產具有重大意義[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土樣采集 取鹽堿地植物根系土壤(表1)。

1.1.2 供試植物品種 ‘鄭單958’玉米種子。

1.1.3 試驗主要器材 植物光照培養(yǎng)箱，LED 植物生長補光燈，紫外分光光度計，H-3400N掃描式電子顯微鏡，光學顯微鏡,VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)。

1.1.4 溶液和培養(yǎng)基的配制 植物營養(yǎng)液為 1 000倍濃縮液，由寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室自制。母液1： CoCl2·6H2O 0.002 g， H3BO31.43 g， MnCl2·4H2O 0.905 g， ZnSO4·7H2O 0.11 g， CuSO4·5H2O 0.051 g， Na2MoO4·2H2O 0.061 g， 去離子水 500 mL；母液2： MgSO4·7H2O 24.648 g，去離子水 500 mL；母液3：K2HPO487.09 g，KH2PO468.443 g，去離子水500 mL；母液4：CaCl2·2H2O 55.495 g，去離子水 500 mL；母液5：FeC6H5O7·3H2O 2.5 g，去離子水 500 mL；母液6：(NH4)2SO40.33 g，去離子水 500 mL。

表1 取樣地基本情況Table 1 Basic situation of sampling sites

以上6種母液各取1 mL與1 000 mL蒸餾水混合即得植物營養(yǎng)液，常規(guī)滅菌后作為正常的植物營養(yǎng)液。

鹽堿脅迫條件確立。溶液Ⅰ：上述6種植物營養(yǎng)液母液各取1 mL加入500 mL蒸餾水中，然后加入3.0 g NaCl，1×105Pa滅菌15 min；溶液Ⅱ 稱量0.8 g Na2CO3加入500 mL蒸餾水中， 1×105Pa滅菌15 min；將滅過菌的溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等量混合制得植物生長培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液pH為9.0，電導率為7.84，其中鹽離子質量分數(shù)達到0.45%。

TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g,大豆木瓜蛋白酶消化物3 g，氯化鈉 5 g，磷酸二氫鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g。

TSA培養(yǎng)基:稱取TSB 30.0 g，瓊脂15.0 g，加入1 000 mL蒸餾水中，1×105Pa滅菌 15 min。

初篩培養(yǎng)基：植物營養(yǎng)液1 mL,0.8 g瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水中，1×105Pa滅菌 15 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化 分別稱取10 g土壤樣品搗碎后，加入到裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩30 min后，進行逐級梯度稀釋。取100 μL適當稀釋梯度的樣品溶液涂布于TSA培養(yǎng)基分離平板。于37 ℃倒置培養(yǎng)24～72 h，用稀釋平皿涂抹法純化3次，獲得純化菌株于4 ℃保藏， 備用。

1.2.2 種子催芽 選取約200粒飽滿無損傷的玉米種子置于500 mL 60 ℃溫水中浸泡到水溫自然降至室溫為止，取出玉米種子，用質量濃度為1 g/L的 HgCl表面[13]消毒30 s，再用無菌水沖洗5次。置于鋪有濕潤無菌紗布的培養(yǎng)皿內，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d至根長為0.5～1.0 cm，萌發(fā)備用。

1.2.3 初篩 平板篩選可促進玉米幼苗耐鹽堿的菌株。催芽后種子與試驗菌株在鹽質量分數(shù)為 0.45%,pH為8.50的固體培養(yǎng)中共培養(yǎng)，分為以下3種處理。CK0處理：無鹽堿脅迫、不接種試驗菌株；CK1處理：鹽堿脅迫、不接種試驗菌株；菌株篩選處理：鹽堿脅迫、分別接種試驗菌株，接種濃度為1×108cfu/mL，接種量為每株 20 μL。

每個處理設置3個重復，所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，16 h光照與18 ℃，8 h黑暗，光照度20 000 lx)中培養(yǎng)，共培養(yǎng)3 d后觀察玉米的長勢，挑選在鹽堿脅迫條件下對玉米生長有顯著促進作用的菌株作為供試菌株。

1.2.4 復篩 水培法篩選促進植物耐鹽堿脅迫菌株。

供試菌株的準備工作：將待試菌株接種到TSA斜面培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，備用。用接種環(huán)挑取待測試菌加入到含有1 mL無菌水的1.5 mL離心管中，制成濃度為1×108cfu/mL的菌懸液，備用。

玉米苗與供試菌株的共培養(yǎng):選取無污染、長勢一致的玉米幼苗，避免選擇過大或過小的幼苗。每組6株玉米苗種于含有500 g白石子的培養(yǎng)瓶中，加入80 mL植物生長培養(yǎng)液，分為3種處理(與初篩一致)。

在培養(yǎng)過程中，實時測定營養(yǎng)液的pH，使其保持穩(wěn)定(pH為9.0±0.2)。

每個處理設置3個重復，所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，16 h光照與18 ℃，8 h黑暗)中培養(yǎng)，共培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計玉米的株高、根長、鮮質量和干質量等生長指標。

1.3 菌株YM6的鑒定

1.3.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)特征觀察 將菌株 YM6 劃線接種在 TSA 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄單菌落形態(tài)；采用革蘭氏染色法和電鏡法觀察細胞形態(tài)[14]。

1.3.2 分子鑒定 將純化好的 YM6菌株送至北京睿博興科生物技術有限公司提取基因組DNA，然后PCR擴增進行sanger測序，對測序結果進行Blast比對。

1.3.3 菌株YM6對鹽、堿及高溫耐性測定 將菌株YM6劃線接種在TSA斜面上，30 ℃培養(yǎng)72 h，備用；用無菌水梯度稀釋制成菌濃度為1×108cfu/mL菌懸液，取1 mL菌懸液分別加入鹽質量分數(shù)為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%的TSB培養(yǎng)液中，180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，在600 nm波長條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對照組測定吸光值；用無菌水梯度稀釋制成菌濃度為1×108cfu/mL菌懸液，取1 mL菌懸液分別加入裝有100 mL的TSB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，9.5、 10.0、10.5、11.0，180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng) 72 h，在600 nm波長條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對照組測定吸光值；用無菌水梯度稀釋制成菌濃度為1×108cfu/mL菌懸液，取1 mL菌懸液加入裝有100 mL TSB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，分別置25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和 50 ℃，于180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，在600 nm波長條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對照組測定吸 光值。

2 結果與分析

2.1 菌株的促生作用

將由根際土壤樣品中分離篩選到的350株分離物與玉米幼苗在平板上培養(yǎng)，共篩選到63株可有效促進玉米幼苗耐鹽堿的菌株。這63株菌株與供試玉米在植物生長培養(yǎng)液共培養(yǎng)14d后，供試玉米生長出現(xiàn)明顯差異，主要呈現(xiàn)3種結果(圖1，2)。

表觀無影響型：在植株色澤、株高、根長、莖粗等方面與對照CK1無明顯差異，有24株菌。

生長減弱或致死型：菌株與供試玉米共培養(yǎng)后，玉米苗出現(xiàn)生長衰弱或死亡，有3株菌。

表觀促生型：供試玉米苗在加入植物生長培養(yǎng)液共生后，長勢明顯強于對照CK1，有36 株菌。

通過3次重復共培養(yǎng)試驗復篩表觀無影響型和表觀促生型的菌株，最終得到44株在含植物生長培養(yǎng)液的樣品中可穩(wěn)定促進玉米生長的菌株，分別為Sh21、NF38、NF89、NF85、cd52、cd51、cd68、Sm3等。

挑選出效果較為明顯且穩(wěn)定的10株供試菌株與玉米于鹽堿脅迫條件下水培，探究生物量差異。

圖1 菌株對玉米抗鹽堿的影響Fig.1 Effect of strain on salt tolerance of corn

圖2 鹽堿脅迫條件下菌株與玉米共培養(yǎng)14 d后生長狀況Fig.2 Growth status of the strain after co-cultivation with maize for 14 days

鹽堿脅迫處理后玉米苗的株高及根長生物量統(tǒng)計結果見表2。在該鹽堿條件下，接種上述10株菌對玉米苗在株高及鮮質量和干質量上比對照均分別有不同增加，說明這10株菌均可以增強玉米苗對鹽堿脅迫的抵御能力且對玉米幼苗有不同程度的促生作用，通過重復試驗，菌株YM6表現(xiàn)最為突出。

2.2 菌株YM6的鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)特征觀察 菌株YM6菌落較大，球狀或橢球狀，乳白色，邊緣褶皺，表面光滑，有粘性(圖3)，革蘭氏陽性菌，可產芽孢，能在堿性條件下生長；在電鏡下觀察菌體為桿狀(圖4)，大小基本為(0.4～0.5) μm×(1.0～1.3) μm。

表2 10株菌接種14 d后玉米苗生長狀況Table 2 Growth status of maize seedlings after inoculation for 10 strains for 14 days

注：“a、b、c、d、e”表示同列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

Note:“a,b,c,d,e” means the same column difference significance result(P<0.05).

圖3 菌株YM6的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of strain YM6

圖4 菌株YM6電鏡觀察結果圖(×20K)Fig.4 Electron microscopic observation of strain YM6

2.2.2 菌株YM6分子鑒定 根據(jù)生理生化及16S rRNA分子生物學鑒定，菌株YM6為Bacillusvelezensis，即貝萊斯芽孢桿菌，該菌株在中國典型微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCM 2018428。

2.2.3 菌株YM6對鹽、堿及高溫的耐性 經試驗測定，在鹽質量分數(shù)為1%時菌株生長最為良好，菌株YM6最大耐鹽質量分數(shù)為10%；pH 7～7.5時生長良好，pH達11.0時不能生長；最適生長溫度為30～31 ℃，可耐受48 ℃高溫(圖5)。

3 討 論

有關促進植物耐鹽堿的微生物研究多見于菌根真菌的研究[10,15-18]。但與真菌相比較，細菌更有利于人工培養(yǎng)并進行工業(yè)生產。有文獻[15]報道，芽孢桿菌屬可有效促進植物生長。目前，關于耐受鹽堿的細菌資源開發(fā)與研究，多聚焦于菌株對鹽或堿的單一耐受性的評價[5]；另外，以往研究方法主要采取自然界篩選耐一定鹽堿度的細菌，再將耐鹽堿菌株與植物在一定鹽堿條件下進行互作檢測，最終獲得耐鹽堿菌種，較為耗時耗力[1,4-5]。本研究利用菌株與植物在鹽堿環(huán)境中的相互作用，直接通過觀察植物的根、莖、葉等表觀現(xiàn)象，可初步篩選出促進植物在中度鹽堿條件下生長的有效菌株。通過上述方法和思路，成功從土壤中分離獲得1株具有明顯促進玉米耐鹽堿性能的細菌，編號為YM6，經鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，具有較大的應用潛力。本研究存在的不足之處為：在植物生長過程中，根系分泌的有機酸導致水培溶液pH變化程度與在自然鹽堿土環(huán)境中不一致。因此，篩選到的有效菌株在實際生產中的效果需進一步驗證。

圖5 菌株YM6耐受性(n=3)Fig.5 Strain YM6 tolerance (n=3)