高佳敏，高素紅,，高寶嘉

(1.河北農業(yè)大學 林學院，河北保定 071000；2.河北科技師范學院 生命科技學院，河北秦皇島 066000)

誘導抗性是系統獲得性抗性，是植物抵抗外來刺激的自我保護方式。這種抗性并不會一直伴隨著植物而存在，只有在受到外界損傷刺激，例如外力造成的機械損傷，昆蟲或其他動物的取食，真菌、病毒等入侵破壞時才能誘發(fā)這種反應[1]，由于它特殊的抗性表達方式，一直是近年來研究的 熱點。

目前，人們研究較多的誘導因子有生物因子、化學因子和物理因子[2]。利用物理、化學或生物的方法，如昆蟲取食、紫外線照射、病菌感染等預先處理植物，使植物產生局部的或者整體的抗性，這就是誘導抗性的含義[3-4]，這些誘導方法已經得到驗證，例如，王炳楠等[5]利用從大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)的胞外分泌物中分離得到一種蛋白做激發(fā)子，成功地誘導煙草植株對煙草花葉病毒(TMV)產生抗性，發(fā)病率大幅度降低；張曉曉等[6]利用短波紫外線照射蘋果，研究對灰霉病的抗性，結果表明，經照射后蘋果果實中的各種防御物質質量分數明顯升高，并且顯著降低果實灰霉病的發(fā)生率。植物經外界刺激或誘導后，會引起植物的一些應激反應，引起植株的生理生化物質質量分數變化，使植物產生抗性。在植物誘導抗性機制的研究中，關注較多的是一些與抗病性相關的酶或其他代謝物質，主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、幾丁質酶、過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚類、木質素、HRGP等[7-9]?，F在人們的研究更多地偏向于2種物質的特異性結合，因為無論哪種途徑都涉及到植物與外源因子的特異性結合，因此一定存在特異性激發(fā)因子誘導基因表達，從而引起一系列的生理代謝活動[10]。植物可通過受體或感應器與激發(fā)子特異性結合而識別昆蟲的活動，植物識別昆蟲激發(fā)子的分子機制尚不清楚，沒有一種激發(fā)子可以誘導所有植物產生防御反應，這也是以后誘導抗性研究的重點之一[11-13]。

葡萄是釀酒的主要原材料，近年來由于綠盲蝽危害，嚴重影響葡萄酒的產量，許多研究者也開始尋找綠色無污染的防治方法。研究較多的是外源因子對葡萄抗性的影響，化學物質是常見的誘導因素。已有研究表明，水楊酸可以誘導葡萄丙二醛質量分數的增加，提高SOD、CAT和POD的活性，從而提高植物抗性[14]。物理因素誘導葡萄抗性也在近幾年有一些報道。陳貴娜[15]測定紫外誘導下葡萄幼苗內白藜蘆醇(天然抗毒素)的質量分數，發(fā)現紫外線可以誘導葡萄產生抗性。生物因子也是誘導產生抗性的，但在葡萄上的研究相對較少。一直以來誘導抗性研究大多都集中在非生物因素對植物抗性的影響，對植物-昆蟲相互作用的研究較少。利用植物自身抗性抵御植食性昆蟲的取食，可以有效減少化學藥劑的使用，也符合環(huán)境友好型的要求。代謝物質是植物抗性的重要指標，它可以反映植株受到脅迫后保持自身系統穩(wěn)定的能力，也可以反映植物主動抵抗外界脅迫的能力，因此，明確代謝物質的變化規(guī)律，是未來研究誘導抗性的重要依據。

本研究通過測定2種方式處理‘赤霞珠’后，葡萄葉片內8種代謝物質量分數的動態(tài)變化，探討誘導方式和誘導強度與誘導抗性的相關性，也為進一步研究誘導抗性的生理生化與分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣地位于河北省秦皇島市昌黎縣河北科技師范學院實驗基地(東經118.45°，北緯 39.72°)，東臨渤海，北依燕山，氣候屬東部季風區(qū)、暖溫帶、半濕潤大陸性氣候，日光照射充足，四季特征明顯，年平均氣溫11 ℃，年平均降水量638.33 mm。試驗樣地主要土壤類型是褐土，土層深厚，輕壤質，通氣性和透水性良好。 ‘赤霞珠’葡萄均采用硬枝扦插，插條均為前一年的沙藏越冬枝條。在清明前后種植，剪穗長度為10 cm左右，存有2 個飽滿的冬芽，扦插前期使用催根粉浸泡24 h，種植株距10 cm、行距30 cm，全年不施用任何農藥。選擇健康無病蟲害、長勢一致、健壯的新生嫩葉作為試驗材料。

綠盲蝽飼養(yǎng)地點為河北科技師范學院昆蟲實驗室，飼養(yǎng)方法：將成蟲置于透明塑料盒中，用豆角飼養(yǎng)，用80網目的紗網封口，放置一些彎曲的紙條以提高存活率。豆角每2 d更換1次，產卵后的豆角重新晾干用于繁殖。放在智能光照培養(yǎng)箱中(溫度為25～27 ℃；相對濕度為50%～70%；光周期為16L∶8D)飼養(yǎng)。

1.2 材料的處理與取樣

試驗在5-7月進行，選擇長勢均勻、無病蟲害的植株作為試驗材料，選擇2～3 齡健康的綠盲蝽若蟲(不分雌雄)供試驗選用。共設置3 個處理，對照、機械損傷處理(用1 號昆蟲針模擬機械損傷，每片針葉刺50 下)和昆蟲取食處理(5頭綠盲蝽取食)，在處理期間均用80 網目的紗網套籠，防止其他昆蟲取食，分別在1 d、3 d、5 d和7 d后取樣，取枝條頂端綠盲蝽取食過的3～4 片嫩葉，樣本迅速放入液氮中，帶回實驗室，-80 ℃保存，備用。

1.3 測定方法

黃酮測定采用乙醇浸提法，縮合單寧測定采用香草醛法，酚類物質的測定采用Folin-酚法，蛋白質的測定采用考馬斯亮藍法，糖類的測定采用蒽酮比色法，游離氨基酸的測定采用茚三酮顯色法，蛋白酶抑制劑類物質的測定采用分光光度計法[16-17]。

1.4 數據處理

用Excel 2003軟件進行數據分析，用SPSS 17.0進行單因素方差分析；以LSD和Duncan氏多重比較分析各處理及不同程度取食方式誘導下與對照的差異顯著性。數據表示形式是“平均數±標準誤”。

2 結果與分析

2.1 不同處理對葡萄次生代謝物質的影響

2.1.1 黃酮質量分數的變化 由表 1 可以看出，在處理1 d后，2 種處理的黃酮質量分數都極顯著高于對照(P<0.01)。在處理3 d后，各處理仍高于對照，僅取食處理的黃酮質量分數差異顯著(P<0.05)。處理5 d的效果與3 d 相似，取食處理對黃酮質量分數變化的影響更明顯。在處理7 d后，機械損傷處理的黃酮質量分數低于對照，而取食處理的黃酮質量分數仍顯著高于對照(P<0.05)。綜上所述：機械損傷在第1 天誘導效果最明顯(與對照相比增加29.2%)，此后效果開始減弱，在處理7 d后低于對照，但是差異不顯著；取食處理的效果隨著取食時間的增加呈現逐漸上升的趨勢，在第7 天達到最大值(與對照相比較增加36.3%)。結果表明，機械損傷和昆蟲取食都能誘導黃酮質量分數的變化，昆蟲取食效果更顯著，機械處理在時效上更及時；從時間上相比，取食處理對黃酮的誘導持續(xù)時間更持久。

表1 不同處理下黃酮的質量分數Table 1 Flavonoid mass fraction under different treatments mg/g

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，同列大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note: Lowercase letters in the same columns indicate significant differences (P<0.05);uppercase letters in the same columns indicate significant differences (P<0.01).The same below.

2.1.2 縮合單寧質量分數的變化 如表2所示，取食處理在第1 天和第3 天誘導的單寧質量分數均極顯著高于對照(P<0.01)；在處理第5天后，取食處理的結果高于對照，低于機械損傷；在處理第7天后，取食處理與對照相比能夠極顯著提高單寧的質量分數，總體呈現升高、降低再升高的趨勢。與對照相比，機械損傷處理的單寧質量分數在第5 天差異顯著(P<0.05)，在第7 天的效果最顯著。2 種處理對縮合單寧的誘導效果相似，單寧的質量分數均在第7 天達到最大值(與對照相比較機械損傷增加74.3%；取食處理增加 63.7%)。從第1 天的結果可以看出， 2 種處理相比較，昆蟲取食對葡萄縮合單寧的誘導更為迅速；機械損傷對縮合單寧的誘導效果更為穩(wěn)定，在處理的時間段均高于對照，并在第7 d達到最 大值。

表2 不同處理下縮合單寧的質量分數Table 2 Condensed tannin mass fraction under different treatments mg/g

2.1.3 總酚類質量分數的變化 酚類質量分數的動態(tài)變化如表3所示。機械損傷處理1 d后，未起到明顯的誘導效果，酚類質量分數極顯著低于對照(P<0.01)。在處理第3天后，與對照相比，機械損傷處理效果差異性顯著(P<0.05)。在處理第5 天和第7 天，處理效果開始減弱，均未達到顯著效果。取食處理對酚類質量分數的影響，在每個時間段都高于對照，除第1 天外，都達到顯著差異，酚類的質量分數也呈現逐漸上升的趨勢。機械損傷處理的總酚類物質的質量分數先降低再升高，取食處理結果則處于持續(xù)升高趨勢。結果表明，昆蟲取食對酚類的誘導更加快速、穩(wěn)定，機械損傷對酚類的誘導存在滯后性。與昆蟲取食相比，機械損傷的誘導效果相對較差。表明不同處理方式對葡萄葉片酚類物質的誘導效果 不同。

表3 不同處理下酚類物質的質量分數Table 3 Mass fraction of phenolic substances under different treatments mg/g

2.2 不同處理對葡萄葉片營養(yǎng)物質質量分數的影響

2.2.1 氨基酸質量分數的變化 從表 4 可以看出，機械損傷和取食處理的效果相似。 2 種處理均在第1 天 時對氨基酸質量分數的影響最明顯，機械損傷處理的氨基酸質量分數變化相比對照增加75.75%，取食處理增加82.58%，均達到顯著性差異。在其他3個時間段， 2 種處理的效果均開始下降，但都高于對照。與對照相比，機械損傷在第5天差異顯著(P<0.05)；取食處理也在第5天達到顯著差異，在第7 天也達到顯著差異，并與對照相比增加28.90%。結果表明，機械損傷和昆蟲取食對葡萄葉片氨基酸質量分數的處理效果相似，對外界刺激均表現出及時的應答反應。氨基酸是蛋白質的重要組成部分，植物受到外界刺激后會產生一系列防御措施，產生的各種物質大多與蛋白質有密切關系。所以氨基酸質量分數的變化與植物的防御反應有關。

表4 不同處理下氨基酸的質量分數Table 4 Amino acid mass fraction under different treatments mg/g

2.2.2 糖類質量分數的變化 從表 5 可以看出，機械損傷對糖類物質的影響沒有明顯的規(guī)律性，處于波動狀態(tài)，與對照相比，在 4 個時間段，均沒有達到顯著性差異。取食處理在第1 天高于對照，其他時間段均低于對照。 2 種處理的結果在 4 個時間段與對照相比有一定差異，但均沒達到顯著性差異。結果表明，2 種處理對糖類物質的誘導沒有明顯的規(guī)律性。糖類物質是植物代謝活動能量的來源，植物受到外界刺激后，會破壞糖類的合成途徑，造成糖類物質不能持續(xù)穩(wěn)定地合成。

表5 不同處理下糖類物質的質量分數Table 5 Sugar mass fraction under different treatments mg/g

2.2.3 蛋白質質量分數的變化 從表 6 可以看出，2 種處理對蛋白質的誘導效果都呈現先降低再升高的趨勢，機械損傷處理的結果在第1 天和第3 天低于對照，在第5天和第7天高于對照，分別增加9.1%、31.14%，在第7 天達到極顯著差異(P<0.01)。機械損傷處理對蛋白質質量分數的影響在3 d以后開始恢復正常水平。取食處理的效果表現比較及時，在處理1 d后，蛋白質質量分數明顯增加，并且差異性顯著。除第3 天以外，其他3個時間段都顯著提高葡萄葉片內蛋白質的質量分數。蛋白質是生命活動的承擔著，是產生各種防御物質的基礎物質，植物受到損傷后，自身會產生補償反應，減少自身的傷害，這可能是蛋白質質量分數增加的原因。

表6 不同處理下蛋白質的質量分數Table 6 Protein mass fraction under different treatments mg/g

2.3 不同處理對葡萄葉片相關酶抑制劑活性的影響

植物體內通常含有多種蛋白酶抑制劑，它能調節(jié)植食性昆蟲消化道內的蛋白酶活性，降低昆蟲的消化功能，從而起到拒食或避食的效果，但通常是微量的，只能對個別昆蟲種群有影響，還不能起到控制整個害蟲種群增長的作用。當植物被植食性昆蟲取食損傷后，其防御系統后接收到信號，其損傷部位的植物組織立刻誘導產生蛋白酶抑制劑誘導因子的損傷激素，但有時這種反應是滯后的，并在很短時間內達到最大值，輸向整個植株，達到整株抗性。同時，這種損傷激素會啟動植物葉片中蛋白酶抑制劑合成途徑，導致蛋白酶抑制劑在體內大量積累，并對取食的昆蟲發(fā)揮作用。

2.3.1 胰蛋白酶抑制劑活性的變化 如表7所示，與對照相比，2 種處理在第1天和第3天的胰蛋的酶抑制劑活性差異均不顯著，在處理第5天，機械損傷處理的胰蛋白酶抑制劑活性極顯著低于對照(P<0.01)。綠盲蝽取食處理誘導的胰蛋白酶抑制劑活性在處理的4個時間段中呈上升趨勢，在第5 天極顯著高于對照(P<0.01)。在處理第7天，機械損傷處理仍然低于對照，而取食處理顯著高于對照(P<0.05)。機械損傷處理的效果呈現升高再降低的趨勢，取食處理效果處于一直升高的趨勢。結果表明：取食處理能夠更顯著、更持久地誘導胰蛋白酶抑制劑的活性；機械損 傷處理在4 個時間段均沒有起到很好的誘導 效果。

表7 不同處理下胰蛋白酶抑制劑的活性Table 7 Activity of trypsin inhibitors under different treatments

2.3.2 胰凝乳蛋白酶抑制劑活性的變化 如表8所示，與對照相比，機械損傷處理的胰凝乳蛋白酶抑制劑活性，在第5 天達到極顯著差異(P< 0.01)，在第7 天達到顯著差異(P<0.05)，在其他時間段，機械損傷處理與對照相比均未達到顯著性差異；取食處理同樣在第5 天和第7 天差異顯著(P<0.01)，其他時間段均未達到很好的誘導效果。在4個時間段，取食危害處理的結果均高于機械損傷。2種處理下胰凝乳蛋白酶抑制劑活性都呈現先升高后降低的趨勢，隨著處理時間和處理程度的增加，植物防御系統受損嚴重，導致胰凝乳蛋白酶抑制劑的合成和分泌受阻，是其質量分數降低的原因。說明2 種處理方法對胰凝乳蛋白酶抑制劑的誘導效果均在第5 天達到顯著性差異，存在一定的滯后性，表明危害初期對葡萄葉片內胰凝乳蛋白酶抑制劑的影響不明顯。

表8 不同處理下胰凝乳蛋白酶抑制劑活性 Table 8 Chymotrypsin inhibitor activity under different treatment

3 討 論

本研究結果發(fā)現，不同處理對葡萄的誘導效應不同；部分次生代謝物質、營養(yǎng)物質和酶抑制劑類的質量分數隨著取食和機械損傷時間的變化而變化；取食和機械損傷處理都能誘導葡萄葉片抗蟲效果產生，有些反應不是及時性的，存在一定的滯后效應；取食處理的效果較機械損傷更顯著。

3.1 不同處理方法對葡萄誘導抗性的影響

已有試驗表明植物在受到為害后產生一系列的防御反應，誘導因素不同，產生的效應不同[18]。研究表明，機械損傷所帶來的只是單純物理刺激，沒有其他因素的影響，而昆蟲的取食刺激則是比較復雜的過程，不只是單純的昆蟲取食所帶來的機械損傷，還有昆蟲口腔分泌物引發(fā)的化學刺激[19]。所以，昆蟲誘導產生抗性的過程更加復雜，這可能是植物防御反應不規(guī)律的原因之一，也就導致不同處理方法所產生效果不同[20-21]。

次生代謝物質質量分數的變化是反應植物抗性的重要指標。當受到昆蟲取食誘導后，這些次生代謝物質質量分數迅速提高，從而對昆蟲的生長發(fā)育、存活及繁殖等產生不利影響，單寧與蛋白質在酶的作用下形成不易消化的復合物，影響昆蟲的消化率及攝食量[22]。次生代謝物質還會吸引傳粉昆蟲，或引誘取食昆蟲的天敵，從而使植物體獲益。因此，植物次生代謝物質具有重要的生態(tài)學意義[23]。本研究結果也表明，無論是機械損傷還是昆蟲取食，葡萄葉片內黃酮、單寧、酚類物質質量分數均有不同程度的增加，表明植物在積極對外界刺激進行防御，昆蟲取食的誘導效果更加明顯，說明2 種方法誘導的途徑不同，所產生的效果也不同。殷海娣等[24]和嚴盈等[25]研究證明昆蟲唾液中存在誘發(fā)因子，能夠誘導植物產生抗性，這是與機械損傷的不同之處。因此，昆蟲誘導植物抗蟲、抗病性機理的研究越來越受到學者的關注。

營養(yǎng)物質是植物和昆蟲生長發(fā)育所必需的原材料。昆蟲通過取食從植物中獲取營養(yǎng)，滿足自身生長，植物受到損傷后通過改變自身營養(yǎng)物質質量分數來調整自身的營養(yǎng)結構，以達到最適的生存狀態(tài)。本研究中葡萄葉片受到綠盲蝽取食后各種營養(yǎng)物質的變化規(guī)律不同。氨基酸和蛋白質質量分數的升高，可能是植物體的一種應激反應，這種現象會在短時間內發(fā)生，但并不會長時間的增加。植物在大量產生一種物質的同時會消耗體內大量的能量，而能量不會供大于求地持續(xù)輸出；植物體受到損傷，營養(yǎng)物質質量分數短暫的升高，是植物減少傷害的一種防御表現。在本研究的測定的時間段內，糖類物質沒有明顯的變化規(guī)律，可能不同植物的效果不同，或者是試驗條件的限制性導致這種現象的發(fā)生。

2 種處理方式對酶抑制劑的誘導很顯著，總體呈現出先升高后降低的趨勢。植物蛋白酶抑制劑對昆蟲的生長、發(fā)育、取食有重要的影響，昆蟲取食蛋白酶抑制劑后會與腸道內的蛋白水解酶特異性結合，降低消化酶類物質的活性，阻斷或削弱蛋白酶對腸道內食物中蛋白的水解，進而刺激植物過量合成和分泌消化酶，引起某些蛋白的缺乏，使昆蟲的正常代謝紊亂，導致昆蟲發(fā)育不正常，最終死亡[26]。從試驗結果中可以看出，通過適當的機械損傷處理可以取得與昆蟲取食相似的效果，這為林木病蟲防治提供了新的思路，而找到合適的損傷程度，以達到最大的誘導效果，需要更多的時間去研究和發(fā)現。

3.2 不同處理程度對葡萄葉片誘導抗性的影響

本研究結果表明誘導強度與誘導效果存在一定的相關性，但并不是嚴格的線性關系。植物產生的抗性具有相對性，在適宜的誘導條件下植物會產生誘導抗性，一旦超過某一個閾值，植物抗性就會隨著處理強度的增加而降低[26-27]。植物的次生代謝物是體內消耗自身營養(yǎng)物質，并通過一系列的轉化所產生。為維持植物體基本生理功能的正常運轉、保證植株生長發(fā)育的正常進行和防御系統的持續(xù)穩(wěn)定，誘導后次生代謝物質的質量分數在短時間增加后，會逐漸下降到正常水平，也可能會出現低于正常水平的情況。所以植物體并不是持續(xù)地大量地表達防御物質，而是隨著外界刺激強度的改變有選擇地、間斷性地、高效地表達以適應外界脅迫[28]。雖然 2 種處理下誘導產生的防御酶種類相似，但在表達量和表達時間上存在一些差異。取食和單純的機械損傷誘導植物產生的防御機制不同，這是導致兩者在物質表達上存在差異的原因。

3.3 環(huán)境條件對植物誘導抗性的影響

在不同的環(huán)境條件下，植物體受到外界刺激因子的影響，都會引起植物的免疫性應答，引起植物代謝物質量分數適應性的變化。已有研究表明化學因素(如外源激素)、生物因素(如昆蟲取食)、物理因素(射線或者物理的機械處理)引起的誘導抗性，都表現出不同的差異性[29-31]。但目前仍有很多關鍵問題需要解決：自然界中哪些可以作為誘導抗性的誘導因子；植物能夠接受的最合理的誘導強度；誘導抗性導致的一些有害物質的積累，對植物是否存在毒害性；誘導產生抗性的揮發(fā)物質對其他植物的影響，這些都是在未來研究中需要解決的。研究者不僅要研究人為處理后各物質的動態(tài)變化，更要注重自然環(huán)境狀態(tài)下植物誘導抗性產生的機理，外界刺激對植物的作用原理，植物從局部抗性到系統抗性調節(jié)的信號分子。隨著基因組學、蛋白質組學、代謝組學的發(fā)展，越來越多的技術和工具運用于誘導抗性的研究，更有助于防御性代謝產物合成機制的研究，加快解決上面的問題，促進目標代謝物質的生產和利用。

綜上所述，不同的處理方法、處理時間、環(huán)境條件等都可能誘導植物的抗性；短期的昆蟲取食和機械損傷可以誘導植物產生抗蟲性，昆蟲取食比機械損傷誘導效果更明顯。在害蟲危害初期，或經歷機械損傷后，一味的使用化學藥劑并不能達到很好的預期效果，而且可能殺害傳粉昆蟲，造成落花落果，在本試驗測定的時間段，胰凝乳蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、單寧、酚類物質都是呈現逐漸升高的趨勢，這也為充分發(fā)揮植物自身抗性，為植物誘導抗性研究提供理論基礎，為未來農作物病蟲害的綜合治理提供依據。