馬 睿，潘陽陽，王 萌，李 秦，何翃閎，胡學權，趙 凌，王靖雷，崔 燕，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院/甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070)

卵丘細胞在卵母細胞發(fā)育過程中扮演重要角色，與卵母細胞形成卵丘—卵母細胞復合體(Cumulus oocyte complexes, COCs)，通過縫隙連接方式與卵母細胞進行物質(zhì)交換，為卵母細胞發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。相關研究表明，卵丘細胞的自噬活動可作為影響卵母細胞質(zhì)量的因素之一，對卵母細胞的發(fā)育和胚胎的形成至關重要[3]。mTOR信號通路是細胞自噬調(diào)控的關鍵使者[4]，mTOR信號通路受到抑制可降低卵母細胞的質(zhì)量[5-7]，影響卵母細胞發(fā)育。胞吞作為細胞生長的又一關鍵生理程序，可通過小窩蛋白與胰島素受體(Ins-R)、表皮生長因子受體(EGFR)、G蛋白α亞基、蛋白激酶C(PKC)、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)及Src家族等多種蛋白相互作用，參與細胞物質(zhì)運輸、脂質(zhì)代謝、細胞信號轉(zhuǎn)導等生物事件，維持細胞的正常生長與質(zhì)量[8]。

哺乳動物細胞受到外界刺激時可啟動細胞自噬維持細胞內(nèi)的穩(wěn)定，也可清除細胞內(nèi)的異常組分[9]。自噬正常生理功能的發(fā)揮需要自噬蛋白與多種活性酶的結合，從而消化降解異常物質(zhì)，更新胞內(nèi)物質(zhì)，傳遞能量，維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬過程中自噬相關基因5(Autophagyrelated gene 5，Atg5)可與Atg12蛋白結合， Atg12-Atg5和Atg16蛋白連接形成一個Atg12-Atg5-Atg16L復合物，在自噬體形成早期起重要作用[10]。Beclin1可與 3-磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)形成Beclin1/PI3K復合物，募集Atg8，最終促進自噬體膜的生成。而微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)可靶向定位于自噬體膜，促進自噬體的形成，對細胞自噬的完成具有重要調(diào)控作用[11-12]。胞吞主要是細胞與外界物質(zhì)交換的主要模式，通過Caveolin1(Cav1)和Caveolin2(Cav2)蛋白在細胞膜形成細胞膜穴樣內(nèi)陷，通過細胞膜脂質(zhì)雙層融合包裹外源成分，形成獨立的囊泡后完成物質(zhì)運輸以攝取外界營養(yǎng)[13-14]。綜上，Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2表達的檢測可作為細胞自噬與胞吞調(diào)控的重要指標。最新研究發(fā)現(xiàn)，在人小梁網(wǎng)細胞和人類乳腺癌細胞及組織的基底細胞中，Cav1蛋白可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)吞和自噬活動，敲除Cav1蛋白可促進細胞的自噬[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)在人類T淋巴細胞中自噬蛋白也可調(diào)節(jié)受體Amyloid precursor protein(APP)的內(nèi)吞作用[16]。這些發(fā)現(xiàn)說明自噬相關蛋白和胞吞相關蛋白的功能之間存在緊密聯(lián)系，研究它們的作用方式十分必要。

胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor，IGF-1)作為細胞生長、卵母細胞成熟、胚胎發(fā)育的重要調(diào)控因子，廣泛分布于卵巢、輸卵管、子宮內(nèi)膜和胎盤等組織[17]。在裸鼠心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，IGF-1可抑制由于血清缺乏及營養(yǎng)匱乏等不利因素所導致的細胞自噬和細胞死亡，并且證明IGF-1是通過作用于AKT通路影響細胞自噬[18]。IGF-1可在多種類型的組織細胞中調(diào)控細胞自噬，如骨腫瘤細胞和血管細胞等。有研究表明，胰島素受體-1(IRS-1)與Cav1蛋白之間有很重要的互作[19]，說明IGF-1對細胞自噬和胞吞都有重要的作用，但目前未見IGF-1對哺乳動物卵丘細胞自噬和胞吞調(diào)控的報道。

本研究在小鼠卵丘細胞體外培養(yǎng)過程中分別添加0、50、100、150和200 ng/mL IGF-1，通過實時熒光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印跡(Western-blot,WB)等方法分別從基因和蛋白水平檢測IGF-1對Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2表達的影響，探索IGF-1參與小鼠卵丘細胞自噬和胞吞的調(diào)控機制，為進一步研究生長因子參與動物生殖相關細胞自噬與胞吞作用，及其對卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

雌性昆明小鼠購于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。在飼養(yǎng)和試驗過程中，遵守清潔級動物管理規(guī)定，控制環(huán)境溫度在26 ℃，注意通風，定期更換墊料和籠具，自由采食和飲水。

1.2 主要試劑

DMEM F12基礎培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，青、鏈霉素，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購于美國Gibco公司；IGF-1、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶等購自美國Sigma 公司。微量RNA 提取試劑盒(Promega, 美國)、兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國)、SYBR GreenⅡ熒光定量PCR 試劑盒(寶生物，大連)，免疫熒光檢測及蛋白免疫印跡所用試劑均購買于南京碧云天生物公司，蛋白免疫印跡所用抗體均購于博奧森公司(北京)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，包括PBS(索萊寶，北京)和甲醇(大茂，天津)等。

1.3 主要方法

1.3.1 小鼠卵丘細胞的收集及培養(yǎng) 選取發(fā)育正常且健康狀況良好的6～8周齡雌性昆明(KM)小鼠，于18:00每只注射PMSG 8 IU，間隔24 h后腹腔注射HCG 10 IU，12 h后，將小鼠脫頸處死，分離輸卵管，在體式顯微鏡下用鑷子撕開輸卵管膨大部，使卵丘-卵母細胞復合體游離于生理鹽水中，在體視顯微鏡下挑選有至少3 層致密卵丘細胞包裹卵母細胞的復合體，透明質(zhì)酸酶消化(1 min)，然后用自制玻璃吸管均勻用力反復吹打卵丘-卵母細胞復合體，使卵丘細胞與卵母細胞分離。將分散的卵丘細胞收集到提前配制好的細胞培養(yǎng)液中，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，重復2次后再用培養(yǎng)液重懸細胞，接種于 25 cm2的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)及傳代。培養(yǎng)液為：DMEM/F12培養(yǎng)基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+150 g/L FBS。

1.3.2 免疫熒光檢測Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白 待細胞生長穩(wěn)定后，取第3代細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化制成細胞懸液，吹打均勻并調(diào)至合適密度(1×104mL-1)，取200 μL懸液滴加于六孔板中的無菌蓋玻片上，于37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱靜置20 min后加入2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細胞長至鋪滿六孔板中無菌玻片的80%左右時，PBS洗3遍(每次5 min)；每孔加入1 mL的4 g/L多聚甲醛，室溫固定1 h，PBS清洗3遍(每次5 min)；每孔細胞加入1 mL 0.05 g/L的Triton X- 100，室溫孵育1 h，PBS精洗3遍(每次5 min)；每孔加入1 mL 10 g/L的BSA，室溫封閉2 h，PBS清洗3遍(每次5 min)；一抗(Rabbit Anti-Atg5，Rabbit Anti-Beclin1，Rabbit Anti-LC3，Rabbit Anti-Cav1，Rabbit Anti-Cav2)4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3遍(每次5 min)；二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP)室溫避光孵育2 h，PBS清洗3遍(每次5 min)；1 μg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′- 6- diamidino- 2- phenylin-dole, DAPI)染色3 min，PBS清洗3遍(每次5 min)；抗熒光猝滅劑封片，在奧林巴斯熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.3.3 IGF-1處理小鼠卵丘細胞 待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，取第4 代細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化成細胞懸液，調(diào)至合適密度(1×105mL-1)后接種至六孔板，分別加入質(zhì)量濃度為0、50、100、150和200 ng/mL 的培養(yǎng)液。放入恒溫箱培養(yǎng)48 h后處理細胞，備用。

1.3.4 總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及PCR反應 細胞培養(yǎng)48 h后，PBS清洗3遍，用微量RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3.5Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2基因表達檢測 使用實時熒光PCR儀檢測Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2mRNA的表達。反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL， Nuclease-Free 水 6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性10 s； 95 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)，每個樣品設置4個重復。引物信息見表1。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Information of primers used in qRT-PCR

1.3.6 Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白表達檢測 用PBS清洗卵丘細胞3次，加入蛋白裂解液充分裂解細胞，10 000 r/min離心15 min，收集上清，置于-80 ℃冰箱保存。沉淀中加入4×SDS上樣緩沖液，100 ℃金屬浴15 min使蛋白充分變性。以10 μL上樣量進行電泳，電泳后通過濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉3 h，一抗4 ℃過夜，PBST(PBS + tween-20)清洗 5 min，重復6次，二抗室溫孵育1 h，PBST清洗3遍，電化學發(fā)光(ECL)試劑盒曝光2～5 min，待蛋白條帶清晰時拍照分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 實時熒光定量結果采用2-△△Ct公式計算目的基因的相對表達量，WB結果利用Image Pro Plus軟件測定蛋白條帶的IOD值，根據(jù)IOD值分析蛋白的相對表達量(蛋白表達量=目的IOD/內(nèi)參IOD)。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，每組至少重復3次，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結果以“平均值±標準誤”表示，使用Graphpad prism 5.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 小鼠卵丘細胞的分離培養(yǎng)

卵丘細胞采用直接接種貼壁法進行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的卵丘細胞以1×105mL-1的初始密度被接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，8 h后，部分細胞由圓形向兩頭伸展成梭形貼壁生長，細胞之間有絲狀聯(lián)系。1 d后，細胞表面出現(xiàn)數(shù)個不規(guī)則的突起，突起部分相互接觸并開始匯合，此時細胞間有大片間隙。2 d后細胞間空隙大幅減少，細胞呈多邊形大量貼壁生長。3 d后細胞呈不規(guī)則的多邊形，匯合成單層將瓶底鋪滿，之后出現(xiàn)接觸抑制。培養(yǎng)過程中細胞鋪滿瓶底80%左右即可傳代， 3～4 d傳代1 次。培養(yǎng)過程中可在培養(yǎng)液的顏色變黃后給細胞換液。傳代培養(yǎng)的細胞在含150 g/L FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中生長旺盛，6 h即可見到細胞貼壁。傳代細胞在早期也呈長梭形，后期出現(xiàn)不規(guī)則多邊形(圖1)。

圖1 第3代小鼠卵丘細胞的生長形態(tài)(100×)Fig.1 Growth pattern of mouse cumulus cells of the third generation (100×)

2.2 卵丘細胞中Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白的分布

對小鼠卵丘細胞進行Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白免疫熒光檢測，結果顯示，正常生長的小鼠卵丘細胞內(nèi)Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白均有表達，主要表達部位為細胞質(zhì)(圖2)。

2.3 IGF-1對小鼠卵丘細胞 Atg5、 Beclin1、 LC3、 Cav1和 Cav2基因表達的影響

研究結果顯示(圖3)，與對照組相比，各處理組自噬相關基因Atg5mRNA的表達量均增大，當IGF-1質(zhì)量濃度為150 ng/mL時，Atg5mRNA表達水平最高，與其他處理組差異顯著；50和150 ng/mL IGF-1顯著抑制Beclin1、LC3mRNA的表達，但100和200 ng/mL IGF-1對Beclin1、LC3mRNA的表達無顯著影響；50和200 ng/mL IGF-1顯著抑制胞吞基因Cav1和Cav2的表達；與50 ng/mL處理組相比，100和150 ng/mL處理組Cav1、Cav2mRNA的表達量有回升趨勢。

紅色熒光為Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白 Red fluorescence: Atg5，Beclin1，LC3，Cav1 and Cav2 protein respectively;藍色熒光為細胞核 Blue fluorescence: cell nucleus

圖2 細胞自噬與胞吞相關蛋白在小鼠卵丘細胞的定位
Fig.2 Localization of autophagy and endocytosis-associated proteins in cells of mouse cumulus

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),下同 Lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)，uppercase letters indicate significant differences (P<0.01),the same below

圖3 IGF-1處理下小鼠卵丘細胞Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2基因的表達量
Fig.3 Expression ofAtg5,Beclin1,LC3,Cav1andCav2genes in mouse cumulus cells under IGF-1 treatment

2.4 IGF-1對Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白表達的影響

研究結果顯示(圖4，圖5)，與對照組 (0 ng/mL)相比，IGF-1刺激ATG5蛋白表達，抑制Beclin1和LC3表達，且在100 ng/mL時最低。此時LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也最低，該比值是評估自噬水平高低的重要標志，比值越小說明細胞自噬水平越低。50和200 ng/mL IGF-1顯著抑制Cav1和Cav2蛋白的表達；但與50 ng/mL處理組相比，100和150 ng/mL處理組Cav1和Cav2 蛋白的表達量有回升趨勢，特別是Cav2蛋白在150 ng/mL作用下表達量顯著高于對照組。

3 討 論

本研究分別從基因水平和蛋白水平檢測不同質(zhì)量濃度IGF-1因子對小鼠卵丘細胞自噬和胞吞活動的影響。分析自噬相關的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：在IGF-1作用下，自噬相關蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白表達量顯著降低，表明細胞內(nèi)自噬水平降低。當IGF-1質(zhì)量濃度為100 ng/mL時，LC3Ⅱ蛋白及LC3Ⅱ/LC3I均顯著降低且降至最低，說明此時IGF-1對小鼠卵丘細胞自噬的抑制效果最好。Beclin1基因存在選擇性剪接的現(xiàn)象[20]，且Beclin1蛋白與Bcl-2蛋白為互作蛋白，常以復合體的形式存在[21]。有研究發(fā)現(xiàn)Beclin1還與Vps34結合形成蛋白復合體[22]，在自噬體形成階段發(fā)揮重要作用，這可能導致Beclin1基因與蛋白檢測結果有差異，具體原因需進一步研究。在IGF-1各個處理組，Atg5 mRNA和蛋白的表達量均高于對照組(0 ng/mL)，可能是由于IGF-1對于自噬起始階段有一定的抑制作用，Atg5主要在自噬誘導階段起作用，并與Atg12和Atg16蛋白形成復合體以促進自噬泡的延伸，IGF-1對細胞自噬的抑制作用可能導致自噬泡延伸過程受阻，Atg5蛋白在體內(nèi)累積，由此出現(xiàn)表達量增大的現(xiàn)象。此時另外兩種自噬相關蛋白Beclin1和Lc3的表達量均下降，證明自噬誘導階段被抑制的可能性 極大。

1～5.IGF-1質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200 ng/mL IGF-1 mass concentration is 50 ng/mL,100 ng/mL,150 ng/mL and 200 ng/mL

圖4 Atg5、Beclin1、LC3、Cav1、Cav2和β-actin蛋白的表達
Fig.4 Expression of Atg5, Beclin1, LC3,Cav1, Cav2 and β-actin proteins

圖5 Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白的相對表達量及LC3Ⅱ/LC3IFig.5 Relative expression levels of Atg5, Beclin1, LC3, Cav1 and Cav2 proteins,LC3Ⅱ/LC3I

Cav在哺乳動物中廣泛表達，但在不同組織中的表達量不同：Cav1在高分化的細胞中呈高表達，如脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及Ⅰ型肺泡上皮細胞，Cav2與Cav1通常共表達，且Cav2必須與 Cav1 結合形成低聚物才能定位至小窩，Cav2與胰島素抵抗過程密切相關[23]。通過胞吞相關數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：IGF-1可調(diào)控Cav1和Cav2的表達，WB結果顯示，與對照組(0 ng/mL)相比，IGF-1質(zhì)量濃度為50 ng/mL和200 ng/mL時，Cav1和Cav2的表達均顯著降低；但在100～150 ng/mL時，Cav1和Cav2的表達量表現(xiàn)出回升趨勢。說明隨著IGF-1質(zhì)量濃度的增大，Cav1和Cav2蛋白的表達量變化趨勢不是單一的上升或者下降，IGF-1對其表達的調(diào)控方式較為復雜，并不是簡單的抑制或者促進作用。

前人研究結果表明，通常膜受體是在細胞膜上的脂筏和質(zhì)膜微囊結構中介導跨膜信號的轉(zhuǎn)導。在 3T3-L1 前脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)，IGF-1受體定位于脂質(zhì)筏和質(zhì)膜微囊中，其信號轉(zhuǎn)導依賴于細胞膜上完整的脂筏和質(zhì)膜微囊結構，且 IGF-1 受體可以直接和Cav1相互作用[24-26]。脂筏和質(zhì)膜微囊主要在受體激活下游信號分子的過程中起作用，而受體本身被配體激活的過程并不需要脂筏和質(zhì)膜微囊的參與，這說明細胞膜上的IGF-1受體定位于脂質(zhì)筏和質(zhì)膜微囊中，使得受體和集聚在脂筏/質(zhì)膜微囊的下游信號分子復合體相互靠近，并通過這些復合體進行信號的傳遞[27]。基于以上理論可看出，IGF-1作用于細胞后的確引起Cav1和Cav2蛋白表達的變化，進一步說明IGF-1因子在小鼠卵丘細胞的胞吞活動及營養(yǎng)物質(zhì)運輸過程中可能起重要調(diào)控作用，但其調(diào)節(jié)Cav1和Cav2蛋白的具體機制及作用方式尚不清楚，還需進一步研究。

自噬和胞吞作用強弱均和 IGF-1 質(zhì)量濃度相關，說明IGF-1可調(diào)控小鼠卵丘細胞自噬及胞吞生理活動，但是小鼠卵丘細胞中自噬和胞吞之間的聯(lián)系尚不清楚。已有研究表明Cav蛋白參與多種生理過程中的分子互作[28]，并且發(fā)現(xiàn)在肺上皮細胞中Cav1可以通過與Atg-5和Atg-12形成的復合物作用而調(diào)節(jié)自噬[29]，本研究發(fā)現(xiàn)，在IGF-1質(zhì)量濃度為50～100 ng/mL時，Cav1和Cav2蛋白的表達水平均顯著增加，Beclin1和LC3I的表達量及LC3Ⅱ/LC3I均顯著增大，表明此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)IGF-1對自噬和胞吞調(diào)控呈正相關；但在IGF-1質(zhì)量濃度為100～200 ng/mL時，Cav1蛋白的表達水平下降，LC3的表達上升，此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，IGF-1對自噬和胞吞的調(diào)控呈負相關。Cav1有破壞Atg5和Atg12復合物的功能，從而抑制細胞自噬[30]。筆者發(fā)現(xiàn)在 100～150 ng/mL時，Cav1和Cav2的表達量表現(xiàn)出回升趨勢，此時細胞自噬抑制效果最為明顯，進一步表明細胞的自噬和胞吞存在一定關聯(lián)，但其具體的作用機制仍需探索。

4 結 論

首次證實在小鼠卵丘細胞的體外培養(yǎng)時，IGF-1可調(diào)控Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2的表達，進一步表明IGF-1參與動物細胞自噬與胞吞的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)細胞自噬和胞吞強度與IGF-1因子的作用質(zhì)量濃度有關，且自噬與胞吞之間具有一定聯(lián)系。本研究對生長因子調(diào)控卵丘細胞的自噬與胞吞，及卵母細胞質(zhì)量與發(fā)育能力等方面研究可資借鑒。