李 巍 高 洋 趙永剛 劉 欣 孫顯輝 呂 彥 張景華

缺血性腦血管病具有高發(fā)生率、高致殘率及高病死率的特點，是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)局灶性缺血所致的神經(jīng)功能障礙[1]。我國每年約有200萬缺血性腦血管病患者發(fā)病，其中60%左右留有不同程度的殘疾[2]。該疾病的病理特征主要表現(xiàn)為頸動脈壁的逐漸變化和動脈的慢性退化，使得動脈變細，導(dǎo)致整個動脈失去彈性。該疾病的形成是一個復(fù)雜的過程，其病因包括飲酒、血液黏滯度升高、高血壓、年齡、吸煙、血糖、高血脂等，相關(guān)的學(xué)說主要有氧化應(yīng)激反應(yīng)學(xué)說、感染學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、炎癥學(xué)說等[3，4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的最重要的血管生成刺激因子，是在牛垂體形狀細胞體外細胞培養(yǎng)分離并純化的糖蛋白，能夠增強內(nèi)皮細胞具有的分裂增生能力，還可以提升毛細血管通透性。其也可參與正常組織形態(tài)的維持和保證細胞排列結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，可保證細胞層的通透屏障功能[5]。中樞神經(jīng)細胞、神經(jīng)細胞可在一些內(nèi)源性因子的刺激下合成、分泌VEGF，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到侵犯后，機體的炎性反應(yīng)與免疫反應(yīng)也可誘導(dǎo)VEGF水平升高[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類新型基因調(diào)控分子，與缺血性腦血管病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNA可影響血管內(nèi)皮細胞的功能，參與血管平滑肌細胞的遷移和增殖。miRNA-132是激活突觸活性和可塑性的分子，在缺血性腦血管病患者中呈現(xiàn)低表達狀況[7]。miRNA-132表達下降可使得內(nèi)皮細胞增殖及遷移能力均受到抑制，進而導(dǎo)致血管出血、破裂，誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生[8]。本研究具體探討了microRNA-132通過調(diào)節(jié)VEGF通路抑制缺血性腦血管病患者血管生成的機制，從而揭示miRNA-132在缺血性腦血管病中的分子作用機制，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1.材料與試劑:人臍靜脈內(nèi)皮細胞來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院的細胞儲藏中心，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2；miRNA-132模擬物(5′-UAACAGUCUACAGCCAUGGUCGACCAUGGCUGUAGACUGUUAUU-3′)和miRNA-132對照模擬物(5′-CGACCAUGGCUGUAGACUGUUA-3′)購自美國Ambion 公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗人HIF-1α、VEGF單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；總RNA抽提試劑盒、Total RNA Kit 購自美國Omega公司。

2.細胞分組與轉(zhuǎn)染：人臍靜脈內(nèi)皮細胞維持對數(shù)生長，轉(zhuǎn)染前1天將處于對數(shù)生長期的細胞分別接種至6孔板中，將其分為空白組、陰性組與實驗組，每組設(shè)3個重復(fù)。待細胞匯合度達60%左右時，空白組不進行轉(zhuǎn)染。陰性組與實驗組經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染對照模擬物及miRNA-132模擬物，轉(zhuǎn)染后6h換液。

3.MTT法檢測細胞增殖：細胞轉(zhuǎn)染后24h與36h，接種到96孔板中，根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100μl細胞懸液，培養(yǎng)2h，加入10μl MTT試劑，再培養(yǎng)4h后測定每孔的450nm吸光度，參比波長600～650nm，計算細胞增殖指數(shù)。

4.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：細胞轉(zhuǎn)染后24h與36h，接種到6孔板，細胞貼壁后用PBS洗滌2 次，加入100μl Binding buffer 和FITC標記的Annexin-V(20μg/ml)10μl，室溫避光30min，再加入PI(50μg/ml)5μl，避光反應(yīng)5min后，加入400μl Binding buffer，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測，記錄細胞凋亡指數(shù)。

5.real-time PCR檢測RNA表達:本研究的miRNA-132及U6特異性擴增引物來源于ABI相關(guān)試劑盒，根據(jù)Genebank查到人HIF-1α、VEGF的mRNA序列。細胞轉(zhuǎn)染后24h與36h收集細胞，提取總RNA，采用兩步法real-time PCR：預(yù)變性95℃，15s；變性95℃、5s，退火延伸60℃、30s，共進行45個循環(huán)，數(shù)值分析采用2-△△CT分析法。

6.Western blot法檢測蛋白表達：細胞轉(zhuǎn)染后24h與36h收集細胞，裂解并提取細胞總蛋白，以BCA法檢測蛋白濃度，每孔上樣20μg蛋白，進行SDS-PAGE膠分離，轉(zhuǎn)膜后封閉過夜，用TBST溶液先快速洗滌3次，孵育一抗過夜；TBST溶液洗滌3次，孵育二抗室溫1h；TBST溶液洗滌3次，將ECL 試劑盒中A 液和B 液按1∶1 體積比例混合于EP管中，均勻覆蓋于膜的表面，避光室溫放置2min，然后進行曝光分析。

結(jié) 果

1.RNA表達比較:轉(zhuǎn)染后24h與36h，實驗組的miRNA-132表達水平顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，HIF-1α、VEGF RNA表達水平顯著低于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

2.細胞增殖指數(shù)比較：轉(zhuǎn)染后24h與36h，實驗組的細胞增殖指數(shù)都顯著低于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

3.細胞凋亡指數(shù)比較：轉(zhuǎn)染后24h與36h，實驗組的細胞凋亡指數(shù)都顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表1 3組轉(zhuǎn)染后不同時間點的RNA表達比較

表2 3組轉(zhuǎn)染后不同時間點的細胞增殖指數(shù)比較

表3 3組轉(zhuǎn)染后不同時間點的細胞凋亡指數(shù)比較

4.HIF-1α、VEGF蛋白表達比較：轉(zhuǎn)染后24h與36h，實驗組的HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量顯著低于陰性組與對照組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖1。

圖1 3組細胞 HIF-1α、VEGF蛋白表達比較A. 24h; B. 36h

討 論

缺血性腦血管病在臨床上比較常見，該疾病的發(fā)生機制尚不十分明確，涉及到血流動力學(xué)改變、微血栓等學(xué)說[9]?，F(xiàn)代研究顯示缺血性腦血管病的病因是血液系統(tǒng)與腦組織之間的直接屏障——腦血管內(nèi)皮細胞被嚴重損傷，特別是損傷引起白細胞和內(nèi)皮細胞持續(xù)性釋放可溶性黏附分子以及各種細胞因子，促使單核細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎?，?dǎo)致疾病的發(fā)生與惡化[10]。

VEGF廣泛存在于機體內(nèi)，主要在血管內(nèi)皮細胞中表達[11]。VEGF能促進血管內(nèi)皮細胞增殖，參與血管的生成，增加血管的通透性，在缺血性腦損傷時具有一定的腦保護作用[12]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是哺乳動物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α在腫瘤細胞中可獲得大量表達，可以激活PI3K/AKT/FRAP途徑，從而調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡[13]。miRNA-132在慢性角膜炎組織中高表達，通過作用于VEGF，參與病毒感染恢復(fù)期血管修復(fù)過程，anti-miRNA-132可以減少角膜血管新生，降低角膜炎損傷[14]。本研究轉(zhuǎn)染后24h與36h，實驗組的miRNA-132表達水平顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，HIF-1α、VEGF RNA與蛋白表達水平顯著低于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明過表達miRNA-132能夠抑制HIF-1α、VEGF的表達。當前也有研究顯示miR-132通過調(diào)控SIRT1信號突進，抑制有利于細胞修復(fù)的脂類物質(zhì)的合成，促進血管內(nèi)皮細胞的炎癥過程，抵制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移的修復(fù)過程，從而使內(nèi)皮細胞活性減低[15]。

現(xiàn)代研究表明,miRNA與疾病發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，特異的miRNA表達譜可作為疾病預(yù)防和診斷的標志物[16～18]。miRNA-126通過加強內(nèi)皮細胞的修復(fù)，發(fā)揮了抗動脈粥樣硬化的作用，也可能通過直接抑制VEGF通路的負性調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞對VEGF的應(yīng)答，從而促進冠狀動脈粥樣硬化[19,20]。HIF-1由α亞單位和β亞單位組成，α亞單位受氧調(diào)控，具有特異性，對HIF-1活性有著決定性作用。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24h與36h，實驗組的細胞凋亡指數(shù)都顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，細胞增殖指數(shù)都顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明過表達miR-132能抑制內(nèi)皮細胞的增殖與促進其凋亡。在未來的深入研究中，還需通過驗證miRNA-132下游靶基因，繼續(xù)闡明miRNA-132參與人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的分子機制，為開發(fā)新的缺血性腦血管病治療手段和方法提供重要的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

綜上所述，miRNA-132可通過抑制HIF-1α、VEGF的表達，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖，促進其凋亡，從而發(fā)揮抑制缺血性腦血管病患者血管生成的作用。