許培培 李梅芳 李連喜 郭明高

近年來(lái)，甲狀腺癌在全世界的發(fā)生率持續(xù)上升，其中最常見(jiàn)的類型為乳頭狀癌，約占所有類型的80%～90%[1]。超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺(ultrasound-guided fine needle aspiration，US-FNA)是診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的重要手段[2]。目前，超聲檢查已經(jīng)成為甲狀腺癌早期診斷的重要方法。研究表明，超聲檢查的甲狀腺結(jié)節(jié)中，90%甲狀腺結(jié)節(jié)為良性，但對(duì)于惡性甲狀腺結(jié)節(jié)，超聲診斷的準(zhǔn)確性仍需提高[3]。分子診斷的不斷發(fā)展，使發(fā)現(xiàn)早期惡性腫瘤成為可能[4]。

FAM172A 基因又名 C5orf21 基因，是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能尚未明確的新基因[5]。本課題組從主動(dòng)脈組織中克隆出了該基因，并初步研究了甲狀腺乳頭狀癌的影響，發(fā)現(xiàn)FAM172A在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)，并促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖[6]。本研究旨在通過(guò)免疫組化和US-FNA，進(jìn)一步探索FAM172A蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價(jià)值。

資料與方法

1.研究對(duì)象：(1)回顧性選取2017年1月～2018年1月在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院外科進(jìn)行手術(shù)治療的甲狀腺腫瘤患者的石蠟切片樣本共70例，其中50例為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer, PTC)，20例為甲狀腺腺瘤(follicular thyroid adenoma, FTA)。(2)前瞻性納入2018年1～6月在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院進(jìn)行超聲檢查懷疑甲狀腺腫瘤的20例患者，通過(guò)FNA獲得細(xì)胞樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①超聲和臨床表現(xiàn)可疑甲狀腺濾泡性腫瘤; ②原發(fā)性甲狀腺腫瘤患者，之前未接受過(guò)甲狀腺手術(shù)；③根據(jù)超聲檢查，甲狀腺結(jié)節(jié)>1cm；④患者自愿進(jìn)行FNA檢查并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①原因不明的出血病史; ②出血傾向(活化部分凝血活酶時(shí)間高于正常上限10s，凝血酶原時(shí)間高于正常上限3～5s，纖維蛋白原<1g/L，血小板計(jì)數(shù)<50000/mm3且聚集功能差，經(jīng)臨床會(huì)診不能進(jìn)行穿刺活檢)；③近期應(yīng)用抗凝血藥物；④嚴(yán)重高血壓(收縮壓>180mmHg,1mmHg=0.133kPa)者；⑤超聲引導(dǎo)下不能確定活檢的合適部位。

2.方法：(1)常規(guī)免疫組化：將石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃ 孵育1h。PBS 沖洗5min，重復(fù)3次。滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃ 孵育30min。PBS沖洗5min，重復(fù)3次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min。PBS沖洗5min，重復(fù)3次。DAB顯色劑顯色15min。自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。(2)US- FNA：患者仰臥位，充分暴露頸前區(qū)。對(duì)暴露區(qū)域進(jìn)行消毒，鋪巾。局部麻醉后，在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺，重復(fù)穿刺3～5次，吸出細(xì)胞樣本涂到玻璃片，涂3～4張，然后將涂片放到95%乙醇槽中固定。術(shù)后對(duì)穿刺點(diǎn)按壓10min止血。(3)細(xì)胞免疫組化：通過(guò)FNA穿刺取得細(xì)胞涂片樣本，經(jīng)95%乙醇固定后，后續(xù)操作步驟同常規(guī)免疫組化。(4)FAM172A評(píng)分：染色結(jié)果由1位病理學(xué)工作者進(jìn)行評(píng)估。具體方法如下，首先計(jì)算染色評(píng)分，在每張片子上隨機(jī)選取3～5個(gè)高倍視野，若細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色則為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞面積所占的百分比來(lái)進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性面積≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。同時(shí)根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：0分為無(wú)染色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。然后將上述染色評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘所得的結(jié)果作為最終的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，采用t檢驗(yàn)比較組間數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.回顧性分析FAM172A免疫組化鑒別乳頭狀癌：對(duì)50例PTC和20例FTA石蠟組織進(jìn)行免疫組化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAM172A蛋白在PTC組織中的表達(dá)顯著高于FTA中的表達(dá)(圖1)。同樣，F(xiàn)AM172A的染色得分在PTC中顯著高于FTA(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 FAM172A在甲狀腺腺瘤和乳頭狀癌中的表達(dá)(免疫組化染色，×200)A.甲狀腺乳頭狀癌；B.甲狀腺腺瘤

圖2 FAM172A免疫組化評(píng)分

2.ROC曲線分析FAM172A最佳截點(diǎn)：基于FAM172A的免疫組化染色評(píng)分，繪制ROC曲線，得出FAM172A評(píng)分為3.5是鑒別良、惡性甲狀腺濾泡性腫瘤的最佳臨界點(diǎn)，具有92%的敏感度和60%的特異性，曲線下面積為0.849(圖3)。

圖3 FAM172A細(xì)胞免疫組化診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線

3.前瞻性分析FAM172A細(xì)胞免疫組化鑒別甲狀腺乳頭狀癌：對(duì)20例疑為甲狀腺腫瘤患者進(jìn)行超聲引導(dǎo)下FNA獲得細(xì)胞樣品，進(jìn)行FAM172A的細(xì)胞免疫組化。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果，20例FNA樣本中有5例PTC和 20例FTA。FAM172A在PTC和FA中表達(dá)的代表性的免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖4。免疫組化結(jié)果顯示FAM172A的表達(dá)在PTC中顯著高于FTA。

圖4 FAM172A細(xì)胞免疫組化在甲狀腺乳頭狀癌和腺瘤中的表達(dá)(免疫組化染色，×400)A.甲狀腺乳頭狀癌；B.甲狀腺腺瘤

4.FAM172A在甲狀腺腫瘤中免疫組化良惡性判定結(jié)果：FAM172A的免疫組化良、惡性判定結(jié)果見(jiàn)表1。FAM172A的免疫組化評(píng)分≥3.5被認(rèn)為是PTC。根據(jù)免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，5例PTC患者全部判定為陽(yáng)性，15例FTA患者中有12例判定為陰性。最終FAM172A鑒別惡性和良性甲狀腺腫瘤的敏感度為100%，特異性為80%。

表1 FAM172A細(xì)胞免疫組化與術(shù)后病理比較 (n)

討 論

由于診斷技術(shù)的進(jìn)步和各種環(huán)境因素的影響，全球甲狀腺癌的發(fā)生率明顯上升。有研究表明，我國(guó)的甲狀腺癌發(fā)生率顯著增加，年均增長(zhǎng)率高達(dá)20.1%，主要類型為PTC[7, 8]。目前，超聲引導(dǎo)下FNAC是診斷甲狀腺乳頭狀癌的重要診斷方法，有著較高的敏感度和特異性，但由于細(xì)胞學(xué)的局限性，仍有10%～40%很難明確其性質(zhì)。隨著分子標(biāo)志物的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的分子標(biāo)志物應(yīng)用到臨床診斷中[9～16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM172A在甲狀腺乳頭狀癌中高表達(dá)，并促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖[6]。FAM172A 在不同的腫瘤中可能發(fā)揮著不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，超聲引導(dǎo)下FNAC聯(lián)合FAM172A細(xì)胞免疫組化有助于甲狀腺乳頭狀癌的診斷，其敏感度為100%，特異性為80%。有研究報(bào)道，US-FNA診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感度和準(zhǔn)確性分別為70.7%和74.4%。進(jìn)一步聯(lián)合BRAFV600E可提高甲狀腺乳頭狀癌診斷的敏感度(86.2% vs 70.7%)和準(zhǔn)確性(87.9% vs 74.4%)[17]。另有研究結(jié)果表明，US-FNA診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感度為78.6%(33/42)，特異性為71.4%(20/28)，ROC曲線下面積為0.750。US-FNA聯(lián)合CK19和Ki-67，ROC曲線下面積可提高到0.858，聯(lián)合CK19和Ki-67檢測(cè)相比于單獨(dú)US-FNA具有更好的診斷價(jià)值[10]。與之前研究比較，F(xiàn)AM172A作為蛋白標(biāo)志物有著更高的敏感度和特異性。

綜上所述，F(xiàn)AM172A作為一種新型蛋白分子標(biāo)志物，能夠?yàn)镻TC患者的確診提供參考，提高PTC診斷的準(zhǔn)確性。但仍需開(kāi)展更多的前瞻性、大樣本研究去驗(yàn)證。