翟 笑 劉潔穎 李融融 劉俊濤 宋英娜 馬良坤 喬宗旭 趙貴芬 王瑞平 張 茜 鄧明群 付俊玲 周麗媛 趙 楠 宋 瑋 肖新華

孕期營養(yǎng)對子代的健康起著非常重要的作用，懷孕期間孕婦營養(yǎng)狀態(tài)異常，可能會導(dǎo)致兒童期及成年早期肥胖及代謝性疾病發(fā)生風(fēng)險增加，目前最新的證據(jù)發(fā)現(xiàn)，微量營養(yǎng)素也在其中發(fā)揮著重要的作用[1～3]。甜菜堿是同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化的重要甲基供體，可滿足快速分裂細胞中甲基的增加需求。因此，適量的甜菜堿供應(yīng)將為表觀基因組編程提供有利環(huán)境。甜菜堿包含在富含小麥的食品中，可以通過氧化必需的營養(yǎng)膽堿來合成[4～6]?，F(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)，孕婦體內(nèi)甜菜堿的狀態(tài)與臍帶血中甜菜堿濃度密切相關(guān)[7]。

小于胎齡兒(small for gestational age, SGA)是指出生體重低于同胎齡兒平均值第10百分位數(shù)的一組新生兒[8]。相比于宮內(nèi)生長正常的嬰兒，因遺傳或環(huán)境因素導(dǎo)致胎兒未達完全宮內(nèi)生長潛能，其成年期慢性病風(fēng)險增加，例如肥胖、2型糖尿病、心腦血管疾病等[9,10]。而在針對動物及人的研究中均發(fā)現(xiàn)，補充甜菜堿可以引起體重及脂肪組織減少，凈體重(lean body mass, LBM)增加，然而孕婦及新生兒體內(nèi)的甜菜堿水平與新生兒出生體重間的關(guān)系尚不明確[11,12]。本研究通過液相質(zhì)譜的方法，比較分析SGA組與適于胎齡兒組(appropriate for gestational age, AGA)兩組孕晚期產(chǎn)婦外周血血漿及新生兒臍血血漿的代謝物差異，發(fā)現(xiàn)兩組的甜菜堿水平存在明顯差異，并進一步分析甜菜堿與新生兒體重間的相關(guān)性，試圖尋找SGA胎兒宮內(nèi)發(fā)育異常的可能機制。

對象與方法

1.研究對象:2017年11月～2018年5月于北京協(xié)和醫(yī)院和邢臺市人民醫(yī)院招募128對足月孕婦及其新生兒(孕周≥37周)，根據(jù)新生兒出生體重，選取其中15例SGA及24例適于胎齡兒(appropriate for gestational age, AGA)的孕婦及新生兒為研究對象[13]。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦方面包括合并高血壓、子癇前期，雙胎或多胎妊娠，合并其他可能會對代謝有影響的疾病(包括甲狀腺功能亢進、肝功能不全、慢性腎炎等)，孕期服用阿司匹林、二甲雙胍、糖皮質(zhì)激素等，孕期有吸煙、酗酒、麻毒藥品使用史等；新生兒方面除外嚴(yán)重畸形、染色體異?；驀?yán)重遺傳病、青紫型先天性心臟病或有血流動力學(xué)改變的非青紫型先天性心臟病。全部患者均簽署知情同意書，本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會許可。

2.研究方法:采集足月孕婦分娩前空腹全血2ml，待胎兒分娩后，新生兒臍帶結(jié)扎后，用注射器抽取臍血2ml。采集血樣裝入含有EDTA作為抗凝劑的采血管中，緩慢上下混勻血液和管壁上的抗凝劑后，在4℃，1000×g(3000r/min)離心力的作用下低溫離心10～15min；吸取上清至干凈的EP管中，保存在-80℃冰箱中。

研究采用超高液相色譜質(zhì)譜法的方法(ultra highperformance liquid chromatography-tandem mass spectroscopy, UPLS-MS)檢測。首先將待測血漿于常溫下解凍，取100μl樣本，加入300μl乙腈，于-20℃預(yù)冷，渦旋振蕩1min后于-20℃靜置過夜。于4℃、12000r/min,離心20min，取上清，1×水稀釋，取其中100μl到進樣瓶。

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class儀器進行色譜分離，色譜條件：HSS-C18色譜柱(100.0mm×2.0mm, 1.7μm)；流動相A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B 相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液；流速0.3ml/min；柱溫40℃；流動相梯度洗脫條件：0～0.5min, 99%A；0.5～2.0min，99%到50%A；2～9min，50%到1%A；9～10min,1%A；10.0～10.5min, 1%～99%A；10.5～12.0min, 99%A。

質(zhì)譜檢測采用Waters公司的XevoG2-XS Qtof系統(tǒng)。Masslynx軟件基于MSE(全信息串聯(lián)質(zhì)譜)模式對樣品進行數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜條件：在正離子采集模式下，毛細管電壓：2.5kV，錐孔電壓24V，離子源溫度100℃，去溶劑氣流速800L/h，錐孔氣流速50L/h，14min內(nèi)對m/z為50～1500Da的離子進行掃描，0.2秒/循環(huán)。在負離子采集模式下，毛細管電壓：2.5kV，錐孔電壓25V，離子源溫度100℃，去溶劑氣流速600L/h，錐孔氣流速10L/h，14min內(nèi)對m/z為50～1500Da的離子進行掃描，0.2秒/循環(huán)。

檢測孕婦血漿中血糖、胰島素水平，胰島素測定使用Siemens Centaur XP 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進行測定，使用Siemens試劑盒，采用直接化學(xué)發(fā)光法，雙抗夾心免疫測定方法進行檢測。糖化血紅蛋白測定采用離子交換高效液相色譜法(試劑盒Bio-Rad Variant Ⅱ Turbo)。

3.統(tǒng)計學(xué)方法：樣品檢測后，經(jīng)Markerlynx軟件(Version 4.1 Waters)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對采集的譜圖進行峰識別、峰對齊等操作，得到數(shù)據(jù)矩陣。再經(jīng)EZinfo軟件(Version 3.0 Waters)進行多元統(tǒng)計分析，以篩選和分組相關(guān)的差異代謝物。建立OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判別分析)散點得分圖。通過HMDB(www.hmdb.ca)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，結(jié)合二級質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品對照，發(fā)現(xiàn)孕婦及臍血甜菜堿水平在兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將檢測到的孕婦外周血血漿及臍血血漿中的甜菜堿濃度通過EXCEL進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，用協(xié)方差分析，對孕婦年齡、孕晚期BMI、胎齡3個的混雜因素進行校正，比較兩組間差異。

結(jié) 果

1.人口學(xué)特征比較:孕婦年齡、分娩時BMI、收縮壓、舒張壓、分娩方式、胎齡、新生兒性別等，在兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其中，兩組中新生兒性別，男性均多于女性，在SGA組更突出，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。

2.兩組孕婦及新生兒臍血代謝組學(xué)聚類分析(OPLS-DA得分散點圖):兩組樣本母嬰血漿代謝物坐標(biāo)點的空間分布差異較大，說明兩組孕婦及新生兒臍血血漿的代謝物分布存在差異(圖1、圖2)。

表1 人口學(xué)特征

圖1 SGA組和AGA組孕婦血OPLS-DA散點得分圖SGA-M.SGA組孕婦；AGA-M.AGA組孕婦

圖2 SGA組和AGA組新生兒臍血OPLS-DA散點得分圖SGA.SGA組新生兒;AGA.AGA組新生兒

3.兩組孕婦及新生兒臍血甜菜堿水平比較及母嬰關(guān)聯(lián)分析:表2及圖3顯示，在校正了孕婦年齡、分娩時BMI、胎齡、新生兒性別后，SGA新生兒血甜菜堿水平顯著低于AGA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.021)。SGA組孕婦的血甜菜堿水平低于AGA組，趨勢明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.09)。兩組中臍血血漿中甜菜堿水平均明顯高于孕婦外周血血漿中甜菜堿水平。孕婦外周血甜菜堿水平與新生兒臍血甜菜堿水平存在明顯相關(guān)趨勢(校正孕婦孕晚期體重、糖化血紅蛋白、新生兒出生體重、新生兒性別)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.394，P=0.069)。

表2 兩組母嬰血漿甜菜堿水平比較

圖3 兩組母嬰甜菜堿水平比較甜菜堿數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)化后結(jié)果；SGA、AGA代表兩組孕婦血漿中甜菜堿水平，SGA-F、AGA-F代表兩組新生兒臍血中甜菜堿水平

4.兩組孕婦孕晚期糖代謝水平比較及與甜菜堿相關(guān)性分析：比較兩組孕婦空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素及HOMA-IR指數(shù)水平，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。孕婦孕晚期甜菜堿水平與空腹胰島素水平、HOMA-IR指數(shù)進行相關(guān)分析，均呈明顯負相關(guān)(r=-0.465,P=0.004；r=-0.548,P=0.000，圖4、圖5)。

表3 兩組孕婦血糖、胰島素水平比較

圖4 孕婦甜菜堿水平與空腹胰島素相關(guān)性曲線甜菜堿為標(biāo)準(zhǔn)化后結(jié)果

圖5 孕婦甜菜堿與HOMA-IR指數(shù)的相關(guān)性曲線甜菜堿為標(biāo)準(zhǔn)化后結(jié)果

5.新生兒臍血甜菜堿水平與新生兒出生體重、臍血胰島素水平相關(guān)性：如圖6所示，新生兒臍血甜菜堿水平與出生體重呈負相關(guān)(r=-0.410，P=0.018)。臍血甜菜堿水平與臍血胰島素水平呈明顯負相關(guān)(r=-0.469，P=0.010)。

圖6 新生兒出生體重與臍血甜菜堿水平的相關(guān)性曲線 胎甜菜堿是指臍血血漿甜菜堿水平，為標(biāo)準(zhǔn)化后結(jié)果

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，SGA組臍血甜菜堿水平明顯高于AGA組，SGA組孕婦血漿甜菜堿水平與AGA組比較，也存在升高趨勢。同時，臍血甜菜堿水平與新生兒出生體重呈明顯負相關(guān)。此前，國外已有2項研究分別報道了孕婦孕期的甜菜堿水平以及臍血的甜菜堿水平與新生兒出生體重呈負相關(guān)，與本研究結(jié)果一致[14,15]。但本研究前瞻性地納入SGA組及AGA組孕婦，孕婦樣本均在孕37周后留取，并進行母嬰配對分析，創(chuàng)新性強，結(jié)果更加可靠。

關(guān)于甜菜堿可影響新生兒出生體重的生物學(xué)機制，目前尚不明確。低出生體重/宮內(nèi)發(fā)育遲緩與成年期肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征等疾病密切相關(guān)，目前來自于動物和人體的研究認為，其中主要的發(fā)病機制，可能與胎兒脂肪發(fā)育不良以及表觀遺傳學(xué)的改變有關(guān)[9,10]。脂肪組織為新生兒體重的重要組成部分，有研究發(fā)現(xiàn)，臍血甜菜堿濃度與新生兒腹部皮下脂肪的減少相關(guān)，因此推測，胎兒的高甜菜堿環(huán)境會改變胎兒期皮下脂肪組織的代謝和形態(tài)[15]。胎兒期脂肪組織的代謝和形態(tài)改變，以及后期出現(xiàn)的嬰兒期的追趕生長，為低出生體重兒成年期發(fā)生肥胖、代謝綜合征的重要原因[16]。綜上所述，胎兒期的高甜菜堿環(huán)境可能會通過影響胎兒的脂肪發(fā)育，而導(dǎo)致成年期代謝綜合征的發(fā)生風(fēng)險增加。

另一機制可能為表觀遺傳學(xué)的改變。甜菜堿為同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化的重要甲基供體，高甜菜堿濃度可引起同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化增加。動物研究發(fā)現(xiàn)，給3月齡母鼠補充甜菜堿可引起子代出生體重下降；伴隨子代IGF-1基因高度甲基化和肝臟IGF-1 mRNA表達的下降[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠期增加甜菜堿攝入可以通過表觀遺傳和糖皮質(zhì)激素受體(GR)介導(dǎo)，減少子代的肝臟脂肪生成[18]。目前暫無人類妊娠期甜菜堿補充與表觀遺傳方面的研究報道，甜菜堿在妊娠期如何通過影響表觀遺傳學(xué)，影響新生兒出生體重，還有待于進一步驗證。

在非妊娠人群和動物的研究中已發(fā)現(xiàn)，補充甜菜堿可以引起體重及脂肪組織減少，凈體重增加；糖尿病預(yù)防計劃(DPP)發(fā)現(xiàn)，甜菜堿水平與2型糖尿病的發(fā)生呈負相關(guān)，且糖尿病高危人群經(jīng)生活方式干預(yù)或二甲雙胍治療，血甜菜堿水平增加[11,12,19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗人群中甜菜堿水平明顯減低，甜菜堿水平與胰島素敏感度明顯相關(guān)；后續(xù)的動物研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿補充劑通過增加成纖維細胞生長因子21(FGF21)的表達來改善大鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)。最新的動物研究發(fā)現(xiàn)，母代補充甜菜堿的子代大鼠的肝臟IGF-2 mRNA和蛋白表達上調(diào)，血IGF-2水平升高；同時，甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的表達增加，IGF-2/H19區(qū)域的甲基化水平上調(diào)「20」。

甜菜堿在非妊娠人群存在代謝保護作用，且與胰島素敏感度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠人群的血甜菜堿水平與空腹胰島素水平、HOMA-IR指數(shù)呈負相關(guān)，這與在非妊娠人群中的報道一致。妊娠人群在產(chǎn)后的胰島素敏感度是否可持續(xù)尚不清楚。

綜上所述，妊娠人群的高甜菜堿血癥與胰島素敏感度增加有關(guān)，但其高甜菜堿狀態(tài)可通過影響臍血甜菜堿水平，引起子代出生體重減少，導(dǎo)致SGA的風(fēng)險增加，是新生兒未來糖脂代謝健康的不利因素。因此，探究妊娠期最優(yōu)的甜菜堿環(huán)境，明確其中潛在的病理生理機制，進而通過對其調(diào)控以減少孕婦及子代未來肥胖、2型糖尿病等疾病的患病風(fēng)險，是今后亟待探求的科學(xué)問題。