番云華 徐龍江 易薇 王冠 王勛 楊必清 葛世軍 孫浩 黃小琴 褚嘉祐 楊昭慶(通信作者)

678400云南省德宏州人民醫(yī)院檢驗科1，云南德宏

650118中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所醫(yī)學遺傳學研究室2，北京

同型半胱氨酸又稱為高半胱氨酸(Hcy)，是人體內(nèi)半胱氨酸與甲硫氨酸代謝過程中生成的中間產(chǎn)物。根據(jù)血同型半胱氨酸臨床診斷標準，人體正常情況下血漿同型半胱氨酸濃度為5～15 μmol/L，濃度高于15 μmol/L 可診斷為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)。近年的研究表明，Hcy 是腦卒中、冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要危險因子[1]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝和同型半胱氨酸代謝的關鍵酶，酶活性的改變能夠影響血液中同型半胱氨酸的水平。MTHFR C677T 錯義突變使密碼子編碼氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，可導致MTHFR 酶的熱穩(wěn)定性和活性下降，導致血漿中Hcy 水平升高[2-4]。遺傳、環(huán)境是影響Hcy 水平的主要因素。目前國內(nèi)尚無傣族人群中MTHFR A1298C(rs1801131)、 C677T(rs1801133)、MTRR A66G(rs1801394)基因多態(tài)性與HHcy的相關性研究。本研究通過對來自云南省德宏州人民醫(yī)院的438 例傣族樣本作為研究對象，探討傣族人群中亞甲基四氫葉酸還原酶 MTHFR A1298C(rs1801131)、 C677T(rs1801133)、甲硫氨酸合成還原酶MTRR A66G(rs1801394)基因多態(tài)性與HHcy的關聯(lián)，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

選擇2016年在云南省德宏州人民醫(yī)院就診體檢樣本438 例，排除吸煙、妊娠人群，且未患有腎功能障礙、惡性腫瘤、尿毒癥、甲狀腺功能低下等影響Hcy 的疾??；其中男192 例，女246 例；平均年齡(65.82±13.29)歲；血漿Hcy＞15 μmol/L 即診斷為高同型半胱氨酸血癥；根據(jù)Hcy 水平將研究樣本分為HHcy組150 例和對照組288例，所有入選者均為本地區(qū)世居的傣族居民；取血檢查前未補充葉酸及B族維生素，未服用影響Hcy水平的藥物，如馬西平、異煙肼等[5-6]。

DNA 提取及Hcy、葉酸測定：所有研究對象均空腹采集外周靜脈血5 mL，2 h內(nèi)離心分離，采用酶循環(huán)法檢測血漿Hcy 水平，電化學發(fā)光法測定血漿中葉酸濃度。

SNP 位點的基因型檢測：實時熒光定量PCR 法進行SNP 分型，用于檢測MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C(rs1801131)、 MTRR A66G(rs1801394)3 個SNP 位 點 的 預 制TaqMan 探針及引物預混液由Applied Biosystems 公司(美國)設計合成，針對單個SNP 位點設計的兩條探針分別用FAM和VIC 熒光基團進行標記。TaqMan 法對rs1801133、rs1801131、rs1801394 位 點進行基因分型，采用羅氏LightCycler480高通量實時熒光定量PCR 系統(tǒng)檢測SNP位點，并用配套軟件(LCS4801.5.1.62)進行數(shù)據(jù)處理得到基因分型。采用二代測序技術對 rs1801133、 rs1801131、rs1801394 位點的基因分型結果進行測序驗證。

結 果

Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗：根據(jù)Hardy-Weinberg 定律，在本研究所選取的樣本中MTHFR C677T(χ2=0.0208，P=0.8855)、 MTHFR A1298C( χ 2=0.3477，P=0.5554)、MTRR A66G(χ 2=1.6572，P=0.1979)，基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，具有較好的群體代表性。同時HHcy組與對照組性別比例和年齡分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

兩組3 個SNP 位點的基因分型比較：采用二代測序技術對rs1801133、rs1801131、rs1801394位點的基因分型結果進行測序驗證，對照組與HHcy 組MTHFR C677T(rs1801133)、 MTHFR A1298C(rs1801131)、 MTRR A66G3(rs1801394)SNP位點的等位基因和基因型頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組3個SNP位點的基因頻率及等位基因頻率分布[n(%)]

兩組 MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C(rs1801131)多態(tài)性位點的連鎖平衡分析：用SHEsis 軟件對MTHFR C677T(rs1801133)、 MTHFR A1298C(rs1801131)2個多態(tài)性位點進行連鎖不平衡分析，rs1801133(C＞T) 和rs1801131(A＞C)之間D'值為0.882，r2 值為 0.073，顯示 rs1801133(C＞T) 和rs1801131(A＞C)位點之間存在強連鎖不平衡。

MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C(rs1801131)、 MTRR A66G(rs1801394)多態(tài)性與血液中Hcy、葉酸水平關聯(lián)性分析：rs1801131 位點AA、AC和CC 3種基因型的樣本中HHcy所占比例、Hcy 和葉酸水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；rs1801133 位 點CC、CT、TT 基因型HHcy 所占比例、Hcy 水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。進一步行同一SNP 位點不同基因型間葉酸和Hcy 水平的兩兩比較顯示：rs1801133 位點的CT 基因型與CC、TT 基因型的血漿中葉酸水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CT 基因型的血漿中葉酸水平低于CC、TT 基因型；rs1801394 位點的AA 基因型與AG、GG基因型的血漿中Hcy水平和葉酸水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；AA基因型的血漿中的Hcy水平和葉酸水平均低于AG、GG基因型。見表2。

表2 兩組各SNP基因型血漿Hcy和葉酸水平及HHcy比例比較

討 論

近年來相關研究表明，血漿同型半胱氨酸水平相關遺傳因素MTHFR 和MTRR 的基因多態(tài)性在各民族和地域的人群中存在群體差異性，然而在我國具體地區(qū)和民族中的遺傳分布仍不十分清楚，使由于同型半胱氨酸水平異常而引起的相關疾病預防工作遇到阻礙。本研究結果顯示，在云南德宏傣族群體中rs1801133、rs1801131、rs1801394 位 點基因多態(tài)性與高同型半胱氨酸血癥無相關性。然而rs1801133 和rs1801394 位點呈現(xiàn)QTL 陽性結果，rs1801133 位點CT基因型與CC、TT基因型比較，血漿中葉酸水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，CT基因型的血漿葉酸水平低于CC、TT基因型；rs1801394 位點AA 基因型與AG、GG基因型比較，血漿Hcy水平與葉酸水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，AA 基因型血漿中Hcy與葉酸水平均低于AG、GG基因型。

近年來，有大量隊列研究表明，MTHFR C677T 位點突變可能是高同型半胱氨酸血癥的危險因素，Kang等對HHcy和MTHFR 基因突變的相關性研究表明MTHFR 基因具有多態(tài)性[7]，其中MTHFR C677T 突變最為常見，該突變降低亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和熱穩(wěn)定性，繼而影響體內(nèi)葉酸代謝，使Hcy 甲基化過程受阻導致同型半胱氨酸在血漿中水平升高。本次研究中，rs1801133 位點CC、CT、TT 三種基因型分布頻率以及C、T 等位基因頻率在HHcy 組與對照組中的差異不具有顯著性。與以往相關研究得出的TT 純合子型患者的Hcy 水平明顯高于同組的CC 純合子型患者的結論不一致[8]。同時CC、CT、TT三種基因型的葉酸水平具有顯著性差異，表明MTHFR C677T 突變可能與MTHFR 酶活性差異有關。

關于MTHFR 基因A1298C 位點的大量群體性調(diào)查研究顯示，該位點的突變分布在不同種族和地區(qū)具有差異性，CC突變純合子在高加索人群中的頻率為10%。而在東亞地區(qū)如中國、日本和韓國人群中一般低于5%[9]。一項納入15 357例樣本的流行病學調(diào)查研究顯示，在我國漢族群體中A1298C的分布具有地理差異，C 等位基因和CC 基因型頻率基本呈現(xiàn)從北到南逐漸升高的趨勢，C 等位基因頻率和CC基因型頻率平均水平分別為18.6%和3.9%[10]。本研究樣本對象中，C等位基因頻率和CC 基因型頻率分別為28.88%和7.76%，顯著高于北方省份如山東省13.1%和1.4%，山西省14.8%和2.2%，河南省14.2%和2.5%。同時我們發(fā)現(xiàn)傣族人群中rs1801131 位點AA、AC、CC基因型攜帶者Hcy水平無明顯差異，與Zappacosta等在意大利中南部人群調(diào)查得到的結果一致[11]。

MTRR 基因A66G 多態(tài)性具有群體差異，為HHcy的重要易感因素。MTRR 是維持依賴與維生素B12的蛋氨酸合酶活性狀態(tài)的黃素蛋白，該酶涉及蛋氨酸合酶、同型半胱氨酸的甲基化代謝，MTRR 66A→G 導致異亮氨酸改變?yōu)榈鞍彼?，可導致體內(nèi)同型半胱氨酸的蓄積。AA 基因型可中度升高同型半胱氨酸水平；與GG 純合子相比，攜帶AA 基因型的人群患心血管疾病的可能性升高4%。本研究認為，rs1801394 位點AA、AG、GG 基因型的Hcy 和葉酸的水平差異有顯著性，表明MTRR A66G 突變可能導致MTRR 酶活性下降，影響Hcy 及葉酸的代謝，造成血漿中Hcy 和葉酸水平的差異[12]。

鑒于Hcy 是心腦血管疾病的一個重要風險因素，通過對Hcy 代謝過程中關鍵SNP 位 點MTHFR A1298C(rs1801131)、MTHFR C677T(rs1801133)、 MTRR A66G(rs1801394)基因多態(tài)性與HHcy表型關聯(lián)性研究，有助于指導臨床醫(yī)生了解不同基因型患者罹患高同型半胱氨酸血癥的風險，從而采取個體化的處方策略，及時調(diào)控患者血漿Hcy 水平，降低多種心腦血管疾病譬如腦卒中和動脈粥樣硬化的發(fā)病風險，預防血漿中高水平的同型半胱氨酸所引起的相關疾病的發(fā)生發(fā)展。由于高同型半胱氨酸血癥的發(fā)生是遺傳和環(huán)境多種因素相互作用的復雜過程，MTHFR 和MTRR 基因的表達可能受到轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中的修飾以及蛋白質(zhì)之間的相互作用影響，從而導致本研究得到的結論與其他相關研究結果具有差異。另外本研究屬于醫(yī)院內(nèi)病例對照研究，樣本偏少，可能存在住院選擇偏倚的情況，因此后續(xù)還需要進行較大規(guī)模的普查研究，以進一步證實研究結論以及進行更深入的研究。