彭微 劉求梅 劉潔 袁桂

412000湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南 長沙

肺癌在我國城市人口惡性腫瘤死亡原因排在第一位，發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢。肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類[1]。非小細(xì)胞肺癌可分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌，約占總體的80%。非小細(xì)胞肺癌與小細(xì)胞肺癌相比，癌細(xì)胞生長分裂比較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚，因而大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者就診時已經(jīng)是晚期，失去手術(shù)的機(jī)會。對于晚期不能手術(shù)的患者，首選采用鉑類藥物治療。盡管非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和治療已經(jīng)取得了一定的成就，但是目前5年生存率仍≤15%，即使早期發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)率仍舊很高[2]，并且在治療中細(xì)胞易對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性。本文就let7a在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的作用及相關(guān)機(jī)制報(bào)告如下。

資料與方法

A549 與A549/DDP 細(xì)胞均采用含10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL青霉素的雙抗1640培養(yǎng)基，放置于飽和適度85%、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。其中A549/DDP 培養(yǎng)基中含有2 μg/mL 的順鉑以維持細(xì)胞耐藥性。所選取的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

方法：將A549 和A549/DDP 細(xì)胞分別接種于含5 mL 1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長到85%融合時，提取總RNA。A549 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24 h 按1.5×105的細(xì)胞數(shù)接種到6 孔細(xì)培養(yǎng)板中，生長到80%左右轉(zhuǎn)染，并對處理前后A549 和A549/DDP 細(xì)胞let7a 表達(dá)水平進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。分別用lipofectamine RNAimax對Let7a抑制物和陰性對照組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cck-8)，將細(xì)胞接種至試劑盒的96 孔板內(nèi)，2 500～3 500/孔，細(xì)胞與壁貼合24 h 后每孔均 加入100 μL 含DDP 的1640 培 養(yǎng)基，A549 細(xì)胞系DDP 濃度為0.25、0.5、0.75、 1.0、 1.25、 1.5、 2.0 μ g/mL，A549/DDP 細(xì)胞系濃度梯度為2.4、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0 μg/mL。同時設(shè)置對照組為孔板只加入單細(xì)胞懸液。酶標(biāo)檢測儀檢測450 nm 波長的吸收值，并計(jì)算細(xì)胞的ic50。取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，并將其在孔板中進(jìn)行稀釋，使細(xì)胞均勻分布。置于飽和適度85%、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，進(jìn)行計(jì)數(shù)克隆。流式細(xì)胞檢測：將A549 和A549/DDP 單細(xì)胞懸液分別接種在6 孔板中，轉(zhuǎn)染并且加藥維持培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿時，消化成單細(xì)胞懸液，離心、漂洗后染色上機(jī)分析細(xì)胞凋亡率(凋亡率=早起凋亡率+晚期凋亡率)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，避免存在偶然性。

觀察指標(biāo)：記錄分析細(xì)胞凋亡率、克隆集落數(shù)量、細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞存活情況、ic50。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0 軟件分析；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；參數(shù)之間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

通過分析比較細(xì)胞凋亡率：A549 轉(zhuǎn)染let7a 抑制物后，細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；A549/DDP轉(zhuǎn)染let7a抑制物后，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

分析比較細(xì)胞ic50 值：A549 轉(zhuǎn)染let7a 后抑制物后細(xì)胞ic50 值增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；表示A549 對順鉑的敏感性下降，耐順鉑性增加；A549/DDP 轉(zhuǎn)染let7a 后細(xì)胞ic50 值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；表示A549/DDP對順鉑的敏感性增加，順鉑耐藥性降低。見表2。

表1 A549與A549/DDP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率比較(±s，%)

表1 A549與A549/DDP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率比較(±s，%)

組別 凋亡率轉(zhuǎn)染前 轉(zhuǎn)染后A549 11.4±0.8 3.5±0.6 A549/DDP 12.1±1.1 14.2±1.3對照組 12.3±1.4 11.2±0.9 P＜0.05 ＜0.05

表2 A549與A549/DDP轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的ic50對比(±s)

表2 A549與A549/DDP轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的ic50對比(±s)

組別 Ic50(μg/mL)轉(zhuǎn)染前 轉(zhuǎn)染后A549 0.42±0.02 0.67±0.01 A549/DDP 5.71±1.30 4.43±1.21 P＜0.05 ＜0.05

實(shí)時熒光定量PCR 檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞株let7a 表達(dá)結(jié)果：A549 細(xì)胞和A549/DDP 細(xì)胞總RNA 經(jīng)提取后，經(jīng)紫外分光光度檢測其純度。結(jié)果A260/A280 的比值為1.58 和1.55，說明總RNA 純度較高。RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染前后let7a 在NSCLC 細(xì)胞株的表達(dá)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后let7a在A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于在A549 中的表達(dá)水平，A549/DDP細(xì)胞表達(dá)水平是A549 細(xì)胞的(25.54±2.90)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

討 論

肺癌居我國惡性癌癥發(fā)生率的榜首，發(fā)病率、死亡率均逐年升高，肺癌中又以非小細(xì)胞肺癌最為多見，占肺癌發(fā)生的80%[3]。非小細(xì)胞肺癌早期癥狀并不典型，主要表現(xiàn)為胸部脹痛、低熱、反復(fù)咳嗽，易與呼吸道疾病混淆，故患者常忽略癥狀，待發(fā)現(xiàn)時癌細(xì)胞已向其他器官擴(kuò)散，錯過治療的最佳時機(jī)。

臨床上現(xiàn)用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物主要為鉑類藥物，包括一代順鉑，二代卡鉑、奈達(dá)鉑、環(huán)鉑，三代奧沙利鉑、洛鉑[4]。順鉑是多種實(shí)體瘤的一線用藥，是化療藥物中高效高毒的典范，居化療藥物第一位，療效客觀，抗癌譜廣。順鉑是鉑的無機(jī)金屬絡(luò)合物，順鉑進(jìn)入細(xì)胞后與氯離子發(fā)生水合，增加了對靶細(xì)胞的攻擊性，通過與細(xì)胞核DNA堿基的結(jié)合，破壞DNA 基本結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA 不能進(jìn)行正常的復(fù)制，抑制細(xì)胞的增殖。有相關(guān)研究表明，順鉑還可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，濃度的增高，會氧化細(xì)胞，破壞其正常的生物學(xué)功能[5]。順鉑藥物在使用前期治療效果非常好，但是后期容易產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致相同劑量的順鉑治療效果不佳，但是增加劑量又會對多個臟器產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性，包括腎毒性、消化道反應(yīng)、耳毒性、骨髓抑制等。因而如何降低順鉑藥物繼發(fā)性耐藥是我們未來亟需解決的問題[6]。

Let7 是2000年Reinhart 在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的一種微小RNA(miRNA)，是一個具有莖環(huán)折疊結(jié)構(gòu)的核苷酸前體分子，具有高度的時序性、保守性和特異性，一共存在13 種家族[7]。在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)上起著重要的作用。Let7可以作為腫瘤診斷標(biāo)記物之一，也可以在治療、用藥、預(yù)后等方面作為參考標(biāo)準(zhǔn)。在不同的腫瘤中l(wèi)et7發(fā)揮作用不同，目前在非小型肺癌中主要參考let7a。let7a重點(diǎn)應(yīng)用于對肺癌的早期診斷與治療[8]。已有相關(guān)研究表明，let7a 的高表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，減少大劑量藥物對正常細(xì)胞的殺傷性。Let7a在肺癌早期即能檢測到其表達(dá)水平的降低，并在治療過程中發(fā)揮對腫瘤的抑制作用，并增加對藥物的敏感性[9]。

本研究中，通過對比A549 與A549/DDP 轉(zhuǎn)染前后let7a 表達(dá)現(xiàn)象以及細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞克隆數(shù)目可得出，A549內(nèi)let7a低表達(dá)會導(dǎo)致A549細(xì)胞ic50值升高，對順鉑的敏感性下降，A549 產(chǎn)生耐藥性。A549/DDP 內(nèi)let7a 高表達(dá)會導(dǎo)致A549/DDP細(xì)胞ic50值下降，對順鉑的敏感性增加。在細(xì)胞平臺克隆實(shí)驗(yàn)中，A549/DDP的let7a高表達(dá)會使細(xì)胞克隆數(shù)減少，細(xì)胞增殖能力降低；而A549 中l(wèi)et7a 的低表達(dá)會使細(xì)胞克隆數(shù)增加，細(xì)胞增殖能力增加。上述結(jié)果證明let7a 作為抑癌基因，其表達(dá)水平能夠影響細(xì)胞的增殖、凋亡以及順鉑的耐藥性。

綜上所述，let7a 在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中可能起著非常關(guān)鍵的作用。let7a 有可能成為肺癌治療的介入靶點(diǎn)，為肺癌的治療提供全新用藥模式，也為研究非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的作用及相關(guān)機(jī)制提供了新的思路和途徑。