李 巍

在全球范圍內(nèi)過(guò)敏性疾病發(fā)病率不斷增高的背景下，近20年來(lái)我國(guó)過(guò)敏性疾病的發(fā)病率也迅速增加[1]。因?yàn)樗拗骰蛟诙虝r(shí)間內(nèi)難以發(fā)生大的變化,一般認(rèn)為環(huán)境因素是導(dǎo)致過(guò)敏性疾病增多的主要原因[2]。人們很早就注意到環(huán)境因素在過(guò)敏性疾病中的作用，20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)農(nóng)村人群過(guò)敏性疾病的發(fā)生率低于城市、兄弟姐妹多的孩子過(guò)敏性疾病發(fā)生率低于兄弟姐妹少的孩子，從而提出了著名的“衛(wèi)生假說(shuō)(hygene hypothesis)”，推測(cè)環(huán)境微生物在過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[3]。近年來(lái)，一系列流行病學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)幼兒時(shí)期避免抗生素、母乳喂養(yǎng)、經(jīng)陰道生產(chǎn)、兒童時(shí)期接觸寵物、母親懷孕期間避免抗生素、母親懷孕期間接觸動(dòng)物等都可以減少過(guò)敏性疾病的發(fā)生[2]。另外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌小鼠自發(fā)產(chǎn)生較高水平IgE[4]；在缺乏微生物的環(huán)境下，小鼠免疫系統(tǒng)傾向于產(chǎn)生Th2應(yīng)答，而微生物的引入則使免疫應(yīng)答向Th1和Th17方向偏移[5]。目前關(guān)于菌群的研究非?；钴S，揭示了其在過(guò)敏性疾病中的重要作用和機(jī)制；也有眾多應(yīng)用益生菌治療和預(yù)防過(guò)敏性疾病的研究報(bào)道，本文就菌群在過(guò)敏性疾病中的作用及干預(yù)做一回顧和討論。

1 菌群是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)

人體生活的環(huán)境中存在著大量的微生物，人體內(nèi)部如腸道和身體表面也存在著大量的微生物，某一生態(tài)環(huán)境內(nèi)的微生物的總和被稱(chēng)為菌群(microbiota)；微生物組(microbiome)是指某一生態(tài)環(huán)境下的所有微生物、編碼微生物的基因以及微生物與宿主和環(huán)境的相互作用[2]。長(zhǎng)期以來(lái)人們主要關(guān)注導(dǎo)致感染性疾病的致病菌，對(duì)腸道和其他身體部位常駐菌在生理和疾病狀態(tài)下的作用直到最近10余年才被廣泛關(guān)注。菌群研究的進(jìn)步在很大程度上得益于二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，目前主要有兩種技術(shù)用于菌群的研究：16s rRNA測(cè)序和宏基因組測(cè)序(metagenomics)[2]。16s rRNA基因是細(xì)菌基因組上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，具有高度的保守性和特異性，通過(guò)特定的引物擴(kuò)增以及高通量測(cè)序，可以分析某一樣本中全部細(xì)菌的種類(lèi)、數(shù)量(豐度)等。宏基因組測(cè)序一般采用鳥(niǎo)槍測(cè)序法(shotgun sequencing)，將基因組打碎成小的片段，連接barcode后高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析得到微生物整個(gè)基因組的序列。宏基因組測(cè)序不僅能夠獲得菌屬種類(lèi)的信息，更重要的是可以反映微生物的代謝等方面的功能，而且可以同時(shí)擴(kuò)增病毒和真菌的序列?；跍y(cè)序技術(shù)的菌群分析克服了以往細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的低通量、低敏感性等不足，極大地推動(dòng)了菌群研究的進(jìn)展，具有劃時(shí)代的意義。

目前關(guān)于菌群研究最活躍的領(lǐng)域是腸道菌群，90%以上的菌群文獻(xiàn)是關(guān)于腸道菌群。最初的研究主要關(guān)注腸道疾病，如炎癥性腸病、便秘等，發(fā)現(xiàn)這些疾病的腸道菌群均發(fā)生顯著改變，給患者移植正常人的糞便或腸道菌群可以有效改善腹瀉或便秘的癥狀[6]；之后研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群也參與了糖尿病和肥胖等代謝性疾病，自身免疫和過(guò)敏等免疫相關(guān)性疾病，癡呆、自閉癥等神經(jīng)精神相關(guān)疾病的發(fā)生；在腫瘤領(lǐng)域，腸道菌群不僅參與了多種消化道腫瘤如結(jié)腸癌、胰腺癌的發(fā)生，也參與了腸道外腫瘤的發(fā)病，在腫瘤治療方面如PD-1抗體的治療，其作用的發(fā)揮依賴(lài)合適的腸道菌群的存在[6]。除腸道菌群外，皮膚菌群、口腔菌群也參與了多種區(qū)域和(或)系統(tǒng)疾病，如皮膚菌群參與了特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)、痤瘡、銀屑病、白癜風(fēng)等皮膚疾病的發(fā)病，也參與了食物過(guò)敏等系統(tǒng)疾病[7]；口腔菌群參與了牙周炎、齲齒等口腔疾病，也參與了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、冠心病、消化道腫瘤等系統(tǒng)疾病[8]。另外呼吸道菌群及生殖道菌群也具有重要的生物學(xué)功能。與過(guò)敏性疾病相關(guān)的菌群主要是腸道菌群和皮膚菌群，鼻腔菌群與過(guò)敏性鼻炎也具有相關(guān)性。

2 過(guò)敏性疾病菌群的變化和作用

過(guò)敏性疾病的一個(gè)顯著特點(diǎn)是過(guò)敏性進(jìn)程(allergy march)，即在嬰幼兒時(shí)期最早出現(xiàn)AD，之后出現(xiàn)食物過(guò)敏，再發(fā)生過(guò)敏性鼻炎和過(guò)敏性哮喘，Th2應(yīng)答和屏障功能障礙是這一系列過(guò)敏性疾病的共同特征，菌群參與了過(guò)敏性進(jìn)程的各個(gè)階段[9]。人們最早關(guān)注的是AD患者的腸道菌群，早期基于16s rRNA擴(kuò)增和測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn)兒童AD患者糞便中細(xì)菌的多樣性下降，在菌屬/種水平的分析發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌、雙歧桿菌以及梭酸芽孢桿菌與AD發(fā)生具有相關(guān)性[10-11]。后續(xù)有研究采用16s rRNA測(cè)序結(jié)合宏基因組測(cè)序的方法分析了AD患者腸道菌群，發(fā)現(xiàn)在多樣性上沒(méi)有差異，普氏糞桿菌的含量升高，膳食纖維代謝產(chǎn)物丁酸和丙酸在糞便中的含量降低[12]。AD患者菌群研究更多的集中在皮膚菌群，研究發(fā)現(xiàn)AD患者皮損和非皮損皮膚的菌群多樣性顯著低于正常人，金黃色葡萄球菌的豐度顯著增高，多種常駐菌如乳酸桿菌、丙酸桿菌的豐度下降[13]； AD患者皮膚菌群的改變與患者年齡密切相關(guān)，在皮損出現(xiàn)之前，皮膚菌群即發(fā)生變化，提示皮炎可能不是菌群發(fā)生改變的原因[14]； AD患者皮膚的宏基因組的分析，在多樣性和菌種水平得到了與16s rRNA測(cè)序相類(lèi)似的結(jié)果，在菌群功能方面，發(fā)現(xiàn)多種代謝通路發(fā)生變化，比較顯著的包括色氨酸代謝通路的改變[15]。

食物過(guò)敏患者的腸道菌群也發(fā)生顯著改變，而且特定菌屬/種跟食物過(guò)敏癥狀的消失相關(guān)。Bunyavanich等[16]發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌和擬桿菌與牛奶過(guò)敏癥狀消失相關(guān)，提示這兩種細(xì)菌可以作為益生菌治療食物過(guò)敏；基于宏基因組的研究顯示，短鏈脂肪酸代謝水平在食物過(guò)敏患者中下降。食物過(guò)敏患者的皮膚菌群也發(fā)生異常，金黃色葡萄球菌的定植與持續(xù)的過(guò)敏癥狀相關(guān)，提示經(jīng)皮致敏以及皮膚炎癥在食物過(guò)敏中可能發(fā)揮作用[17]。對(duì)哮喘患者腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘高風(fēng)險(xiǎn)的患兒在3個(gè)月大時(shí)腸道菌群紊亂，毛螺菌屬、韋榮球菌屬、糞桿菌屬和羅思菌屬的豐度低于正常對(duì)照，糞便中菌群代謝產(chǎn)物乙酸含量降低，向小鼠模型補(bǔ)充上述4種菌屬，可以緩解呼吸道的炎癥[18]。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒時(shí)期的糞便菌群從組成上分為3種模式，與2～4歲發(fā)生的過(guò)敏癥狀如哮喘具有不同的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，其中高風(fēng)險(xiǎn)模式中雙歧桿菌屬、AKK菌屬和糞桿菌屬的豐度顯著降低[19]。

綜上，腸道菌群與過(guò)敏性疾病的發(fā)生相關(guān)，在嬰幼兒和兒童時(shí)期這一相關(guān)性最為顯著和確鑿，隨著年齡的增加，這種相關(guān)性逐漸消失。這一現(xiàn)象提示，生命早期菌群對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮著非常顯著的影響，有可能確立機(jī)體的Th2“免疫背景”，之后在相應(yīng)環(huán)境因素的作用下，皮膚屏障或呼吸道屏障的區(qū)域免疫應(yīng)答向Th2偏移，最終發(fā)生過(guò)敏性疾病。

3 益生菌在過(guò)敏性疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用

人們很早就嘗試改變腸道菌群以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，如食用酸奶等富含乳酸菌的食品改善便秘等消化道癥狀。近年來(lái)菌群的研究為利用腸道菌群治療疾病提供了新的依據(jù)，也使得治療更具有針對(duì)性。益生菌(probiotics)指一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道等部位、能產(chǎn)生確切的健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱(chēng)；益生元(prebiotics)是一種可通過(guò)選擇性地刺激一種或數(shù)種菌落中的細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性而對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響的物質(zhì)[2]。

益生菌的選擇一般是基于對(duì)患者腸道菌群的數(shù)據(jù)分析，或者根據(jù)對(duì)不同功能的菌種進(jìn)行篩選的實(shí)驗(yàn)室研究，之后在動(dòng)物層面證實(shí)益生菌的治療和預(yù)防效果，最后開(kāi)展臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[20]。有研究組將不同的細(xì)菌刺激體外培養(yǎng)的小鼠腸道樹(shù)突狀細(xì)胞，篩選可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的菌種，之后將篩選到的細(xì)菌口服應(yīng)用于小鼠，分析這些細(xì)菌對(duì)多種炎癥性疾病模型的作用，發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊乳桿菌、嗜熱鏈球菌的組合可以有效誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生，抑制AD等小鼠炎癥模型[20]。其他的一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也研究了不同菌種在預(yù)防和治療AD、過(guò)敏性哮喘等模型中的作用，均顯示了一致的良好治療和預(yù)防效果[20]。益生菌在過(guò)敏性疾病中的治療/預(yù)防作用主要有四方面的機(jī)制：(1)調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡；(2)誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生；(3)促進(jìn)抗原特異性IgG/IgA產(chǎn)生，抑制抗原特異性IgE產(chǎn)生；(4)拮抗致病菌，維持黏膜屏障，促進(jìn)抗微生物肽的產(chǎn)生等[20]。

基于臨床和實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，人們開(kāi)展了一系列臨床試驗(yàn)來(lái)研究益生菌在治療和預(yù)防過(guò)敏性疾病中的作用，目前的研究主要集中在AD，應(yīng)用的細(xì)菌主要是雙歧桿菌和乳酸桿菌。在AD治療方面，來(lái)自多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的結(jié)果不盡相同，一篇納入了25項(xiàng)臨床試驗(yàn)、1 599名病例的薈萃分析文章顯示，益生菌治療對(duì)于1～18歲AD患者有效，小于1歲AD患者無(wú)效；不同細(xì)菌混合或不同乳酸菌種混合的效果優(yōu)于單獨(dú)雙歧桿菌[21]。另一篇納入了13項(xiàng)臨床試驗(yàn)的薈萃分析文章顯示益生菌在匯總分析層面沒(méi)有顯示出與對(duì)照組的差異，但在進(jìn)一步的分層分析中發(fā)現(xiàn)：益生菌治療對(duì)于亞洲AD患者有效，歐洲患者無(wú)效；重度AD有效；1～18歲AD有效；鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌無(wú)效，發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌以及混合菌種對(duì)兒童AD治療有效[22]。而在預(yù)防方面，薈萃分析顯示，益生菌的使用對(duì)于AD的預(yù)防具有一定效果[23]。對(duì)食物過(guò)敏的益生菌治療，研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌與深度水解奶粉同時(shí)使用，可以有效減少牛奶過(guò)敏兒童的伴發(fā)過(guò)敏癥狀，促進(jìn)對(duì)牛奶的耐受；一項(xiàng)RCT研究顯示，鼠李糖乳桿菌與口服免疫耐受同時(shí)使用可以增加口服免疫耐受的效果[20]。在過(guò)敏性鼻炎和哮喘方面的益生菌治療研究較少，目前沒(méi)有確定的結(jié)論。

造成不同研究之間結(jié)果差異的原因在于：(1)樣本量偏小；(2)受試者所屬地域、種族的不同；(3)研究所采用的菌種的差異；(4)納入患者的年齡不同[20]。目前各國(guó)際主流學(xué)會(huì)尚未推薦將益生菌用于過(guò)敏性疾病的預(yù)防和治療。WAO基于29個(gè)臨床試驗(yàn)的一項(xiàng)薈萃報(bào)告認(rèn)為，目前尚沒(méi)有足夠的證據(jù)支持推薦將益生菌用于過(guò)敏性疾病的預(yù)防；但是對(duì)于有過(guò)敏性家族史的孕婦和哺乳婦女，使用益生菌可能是有幫助的；因?yàn)樽C據(jù)不足，目前尚沒(méi)有推薦具體的菌種/菌株及劑量用于預(yù)防或治療[24]。使用益生菌可能的風(fēng)險(xiǎn)包括系統(tǒng)感染、影響宿主代謝功能、易感個(gè)體的過(guò)度免疫應(yīng)答、基因轉(zhuǎn)移等等；另外在技術(shù)上也存在一些問(wèn)題，如標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)菌的定量等等。因此，目前還需要繼續(xù)深入研究菌群在過(guò)敏性疾病中的作用和機(jī)制，以選擇更加有效的菌株開(kāi)展治療和預(yù)防研究，也需要采用標(biāo)準(zhǔn)化并統(tǒng)一定量的菌株進(jìn)行大樣本、多中心的臨床研究以進(jìn)一步闡明益生菌的治療/預(yù)防作用。

4 展望

目前的研究已經(jīng)初步揭示了菌群在過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要的作用，但具體機(jī)制尚未完全闡明。在應(yīng)用方面，菌群的代謝產(chǎn)物更能夠體現(xiàn)菌群的功能，以往研究已經(jīng)揭示了菌群代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答中的作用[25]，代謝產(chǎn)物作為小分子化合物可以克服活菌(益生菌)的諸多不足，有可能成為未來(lái)治療的主要方向。