李夢(mèng)霖 阮羽萱 杜可心

摘要：油菜菌核病是一種嚴(yán)重危害油菜生長的病害。于2017年3月從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)田采集油菜湘油15盛花期植株的根莖葉，采用純培養(yǎng)法對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，共分離得到68株內(nèi)生細(xì)菌;采用基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析法對(duì)內(nèi)生菌株的多樣性進(jìn)行分析研究;利用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)內(nèi)生菌株進(jìn)行抗菌活性篩選，共篩選出7株抗菌活性較強(qiáng)菌株，分別為Y171004、Y172014、Y173005、Y174007、Y174017、Y177001和Y177002;利用平板對(duì)峙法對(duì)油菜菌核病病原菌核盤菌的拮抗菌進(jìn)行篩選，篩選出2株（Y171004和Y177002）油菜核盤菌的拮抗細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus），繼而對(duì)其拮抗活性進(jìn)行初步分析，其中菌株Y171004的抗菌物質(zhì)經(jīng)鑒定為熱不穩(wěn)定性蛋白。研究結(jié)果能為該地區(qū)油菜內(nèi)生細(xì)菌資源的進(jìn)一步研究及其在油菜菌核病生物防治等方面的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：油菜菌核病;內(nèi)生細(xì)菌;拮抗;熱不穩(wěn)定性蛋白;抗菌活性;新型藥劑開發(fā)

中圖分類號(hào)： S435.654 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）13-0121-05

油菜（Brassica napus L.）是蕓薹屬的一年生或越年生草本植物，是我國最重要的油料作物，也是世界四大油料作物之一[1]，我國油菜的種植面積以及產(chǎn)量均占全世界油菜的30%左右[2]。油菜的生長周期較長，需要對(duì)抗的病害種類較多，以油菜菌核病、病毒病[3]、白銹病、黑斑病等為重要病害[4]，導(dǎo)致油菜減產(chǎn)最嚴(yán)重的是油菜菌核病。油菜菌核病是由油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape）感染引發(fā)的一類子囊菌寄生型病害[5]，其危害導(dǎo)致的減產(chǎn)量占總危害減產(chǎn)量的80%。

目前，油菜菌核病的防治方法主要是化學(xué)防治，會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重污染，在這種形勢(shì)下生物防治成為當(dāng)前對(duì)油菜菌核病防治的主要途徑。生物防治主要是利用微生物本身或其次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制核盤菌的生長，內(nèi)生細(xì)菌作為一種非常重要的微生物資源，近些年來逐漸成為微生物資源研究的重點(diǎn)之一。

目前對(duì)油菜菌核病的研究較多，但未見從油菜中分離出內(nèi)生細(xì)菌以篩選菌核病拮抗菌的報(bào)道。本研究從甘藍(lán)型油菜湘油15的根莖葉中分離內(nèi)生細(xì)菌并進(jìn)行抗菌活性篩選鑒定，對(duì)菌核病拮抗菌的抗菌物質(zhì)進(jìn)行初步研究，以期為開發(fā)新型防治菌核病的防治藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試內(nèi)生細(xì)菌 樣品采集于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地，油菜品種為甘藍(lán)型油菜湘油15，種植150 d時(shí)進(jìn)行采樣，隨機(jī)選取3株作為樣品，采集根莖葉，于4 h內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌處理。

1.1.2 供試敏感指示菌和病原菌 6種供試敏感指示菌分別為大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 128、變形桿菌（Proteus vulgaris）ATCC 8427、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 6051、藤黃八疊球菌（Sarcinalutea）GC-MCC 1.880、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25922、黑曲霉（Asperillus niger）NCPC 1003，病原菌為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜內(nèi)生細(xì)菌的分離 用自來水將樣品洗凈，吸干水分后稱取根莖葉各5 g進(jìn)行消毒滅菌處理。無菌研缽研磨[6]，制成0.100 0%、0.010 0%、0.001 0%、0.000 1%稀釋液，各取200 μL涂布肉湯瓊脂培養(yǎng)基（LBA）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基（牛）、10%莖桿汁特殊因子培養(yǎng)基（T），3個(gè)重復(fù)，取最后1次沖洗的無菌水涂布平板作為對(duì)照。培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落并編號(hào)，在對(duì)應(yīng)的分離培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上采取三區(qū)劃線法進(jìn)行純化3～4次。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等特征，對(duì)分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行比較分析歸類，利用基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析法和蛋白酶K法，對(duì)差異較大的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。擴(kuò)增反應(yīng)引物為正向引物16S8F（5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和反向引物16S1506R（5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix（Mg2+）25 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序，將序列結(jié)果提交GenBank注冊(cè)得到序列號(hào)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線相似序列比對(duì)，保存相似性較高的已知序列到本地txt文本，運(yùn)用Clustal X[7]和MEGA 6.0[8]構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 活性菌株的篩選及其生物學(xué)特征 以大腸桿菌ATCC128、變形桿菌ATCC8427、枯草芽孢桿菌ATCC6051、藤黃八疊球菌GC-MCC1.880、金黃色葡萄球菌ATCC25922、黑曲霉NCPC1003作為供試敏感菌株，采用瓊脂擴(kuò)散法[9]，挑取單菌落接種于裝有50 mL液體LB培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，發(fā)酵液 9 500 r/min 離心10 min，直徑為6 mm的2層濾紙片沾取上清進(jìn)行抗菌活性篩選，待濾紙片周圍出現(xiàn)明顯透明圈時(shí)記錄抗菌圈直徑，確定活性菌株。利用革蘭氏染色和芽孢染色對(duì)活性菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，以6個(gè)溫度梯度、6個(gè)pH值梯度、5個(gè)鹽濃度梯度等指標(biāo)對(duì)活性菌株進(jìn)行生長情況測定，培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉和吐溫-20測定菌株產(chǎn)胞外酶特性。

1.2.4 拮抗菌株的篩選 采用平板對(duì)峙法，取邊長為 0.5 cm 正方形病原菌塊接于PDA平板中央，將“1.2.3”中篩選得到的活性菌株等距接于病原菌塊四周，每個(gè)菌株3組重復(fù)，不接待測菌株只接病原菌株的平板作為空白對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)。待空白對(duì)照組的病原菌長滿整個(gè)平板后觀察試驗(yàn)組病原菌生長情況，確定拮抗菌株。

1.2.5 拮抗菌株對(duì)病原菌絲的影響 蓋玻片洗凈，75%乙醇浸泡5 min后晾干，傾斜插于拮抗菌與病原菌中間，待受到抑制作用的病原菌絲長到蓋玻片上時(shí)取出鏡鑒。

1.2.6 拮抗物質(zhì)的初步鑒定及耐熱性分析 選取生長1 d的幼齡拮抗菌株，接種于裝有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 150 mL 錐形瓶中，28 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，發(fā)酵液 9 500 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移40 mL上清入新的離心管，每管加入20 g硫酸銨，全部溶解后在4 ℃冰箱中過夜，9 500 r/min離心30 min，去上清留沉淀，2 mL無菌水溶解，0.22 μm 過濾器過濾除菌體，得到蛋白粗提物[10]，測定其抗菌活性。將蛋白粗提物置于95 ℃中水浴30 min，測定其抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜內(nèi)生細(xì)菌的分離

將甘藍(lán)型油菜湘油15根莖葉的研磨液接種到4種培養(yǎng)基上，觀察分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由表1可知，從LBA培養(yǎng)基上分離得到26株內(nèi)生細(xì)菌，從NA培養(yǎng)基上分離得到6株內(nèi)生細(xì)菌，從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上分離得到13株內(nèi)生細(xì)菌，從T培養(yǎng)基上分離得到23株內(nèi)生細(xì)菌，共分離出68株細(xì)菌。其中LBA、T這2種培養(yǎng)基的分離效果最好，分別為26、23株，分別占總分離菌株的38.24%、33.82%。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等特征，對(duì)68株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行比較去冗余，最后選取差異較大的18株代表性內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見表2：18株內(nèi)生細(xì)菌屬于細(xì)菌域（Bacteria）的2個(gè)門[厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）]的3個(gè)科[芽孢桿菌科（Bacillaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）]，4個(gè)屬：芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、拉恩氏菌屬（Rahnella）和埃希氏菌屬（Escherichia）。其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，菌株數(shù)分別占測序菌株的44.44%（8株）和38.89%（7株），說明芽孢桿菌和假單胞菌是油菜內(nèi)生細(xì)菌中的常見細(xì)菌。其次是拉恩氏菌屬2株和埃希氏菌屬1株，顯示了油菜內(nèi)生細(xì)菌較高的類群多樣性。

2.3 活性菌株的篩選及其生物學(xué)特征

由表3可知，用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離的68株內(nèi)生菌進(jìn)行抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)有7株菌株（Y171004、Y172014、Y173005、Y174007、Y174017、Y177001、Y177002）的發(fā)酵液至少對(duì)1種指示菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。其中Y171004對(duì)4種指示菌有

抗菌活性;除了Y173005外，其他6株菌株均能抑制革蘭氏陽性菌株金黃色葡萄球菌的生長，表明植物組織中含有非常豐富且有待開發(fā)的產(chǎn)活性物質(zhì)菌株，是微生物資源的一大寶庫。

以6個(gè)溫度梯度對(duì)7株活性菌株進(jìn)行生長情況測定。由表4可知，大部分菌株均能在25～40 ℃之間生長，菌株Y177001和菌株Y177002在25～50 ℃之間生長良好，具有較廣的生長溫度范圍且具有耐高溫的特性。菌株Y174007不能在弱酸性環(huán)境、無鹽、高鹽環(huán)境下生長，其他6株菌均能在pH值為5～10之間、鹽濃度為0～2%之間生長;菌株Y177001和菌株Y177002在鹽濃度為0～7%環(huán)境下均能生長，具有較廣的生長鹽度范圍和一定的嗜鹽性。

以Stackebrandt等提出的16S rRNA基因序列相似性小于97%的菌株屬于不同物種的論點(diǎn)為基本原則[11]，并與各類群（科、屬）已知物種進(jìn)行對(duì)比分析，在系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，初步確定試驗(yàn)菌株的物種歸屬。結(jié)果表明，18株分離菌株可以歸為14個(gè)不同的物種，且大多數(shù)分離菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的已知物種的典型菌株間存在著一定的遺傳差異（序列相似性1株100%，其他98.31%～99.93%）。這些結(jié)果表明分離的油菜內(nèi)生細(xì)菌的物種多樣性和遺傳多樣性較高。

選取7株活性菌株中形態(tài)差異較大的5株進(jìn)行培養(yǎng)特征觀察，結(jié)果如圖1所示。菌株Y171004、Y172014、Y173005、Y174017和Y177002均能在LBA培養(yǎng)基上生長良好，均用平板對(duì)峙法測定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)核盤菌的拮抗作用。由圖2可知，菌株Y171004和菌株Y177002對(duì)核盤菌菌絲的生長有抑制作用，能形成較為明顯的抗菌圈。分析測量結(jié)果，菌株Y171004對(duì)核盤菌的抗菌圈平均直徑為11.5 mm，菌株Y177002對(duì)核盤菌的抗菌圈平均直徑為19.0 mm，且抗菌圈周圍的菌絲顏色變深。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后觀察發(fā)現(xiàn)，菌株Y171004對(duì)核盤菌的抗菌圈依舊存在，但是對(duì)匍匐菌絲的抑制能力逐漸減弱，匍匐菌絲緩慢生長蓋過Y171004菌體，菌株Y177002對(duì)核盤菌的抗菌圈大小沒有明顯變化。

2.5 拮抗菌株對(duì)病原菌絲的影響

用埋片法檢測菌株Y171004、Y177002對(duì)病原菌絲的影響。由圖3可知，被Y171004菌株分泌物處理過的病原菌菌絲表現(xiàn)出菌絲皺縮，從培養(yǎng)基上肉眼觀察發(fā)現(xiàn)抗菌圈周圍的菌絲較疏松。被菌株Y177002分泌物處理過的病原菌菌絲表現(xiàn)出菌絲膨大變粗且變黑，從培養(yǎng)基上肉眼觀察發(fā)現(xiàn)抗菌圈周圍的菌絲變黑或變褐。

2.6 拮抗物質(zhì)的初步鑒定及耐熱性分析

菌株Y171004和Y177002發(fā)酵液的蛋白粗提物對(duì)病原菌生長的影響如圖4所示。菌株Y171004的蛋白粗提物對(duì)病原菌具有抑制作用，并且抑制效果比平板對(duì)峙法的抑制效果明顯。而菌株Y177002的蛋白粗提物對(duì)病原菌沒有抑制作用，說明其抗菌成分為非蛋白類物質(zhì)。

菌株Y171004的發(fā)酵液蛋白粗提物經(jīng)95 ℃水浴30 min后對(duì)病原菌生長的影響如圖5所示。菌株Y171004的蛋白粗提物經(jīng)水浴處理后對(duì)病原菌沒有抗菌作用。確定菌株Y171004的拮抗物質(zhì)為不具耐熱性的蛋白類物質(zhì)。3 結(jié)論與討論

本研究從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地采集的油菜根莖葉中分離出68株內(nèi)生細(xì)菌，比較菌落的形態(tài)、大小、顏色等特征，最后選取差異較大的18株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。18株內(nèi)生細(xì)菌屬于細(xì)菌域的2個(gè)門的3個(gè)科的4個(gè)屬：芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、拉恩氏菌屬和埃希氏菌屬。其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，菌株數(shù)分別占測序菌株的

44.44%（8株）和38.89%（7株），說明芽孢桿菌和假單胞菌是油菜內(nèi)生細(xì)菌中的常見細(xì)菌。其次是拉恩氏菌屬2株和埃希氏菌屬1株，顯示了油菜內(nèi)生細(xì)菌較高的類群多樣性。

篩選出7株具有抗菌活性的菌株，經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析和菌株生理生化研究，初步鑒定菌株Y171004、Y172014、Y174007、Y177001、Y177002為芽孢桿菌屬;菌株Y173005為假單胞菌屬，菌株Y174017為腸桿菌屬。菌株Y177001和菌株Y177002能在25～50 ℃之間生長良好，并且在鹽濃度為 0～7%的環(huán)境下均能生長，具有較廣的生長鹽度范圍和較廣的生長溫度范圍，具有耐高溫的特性和一定的嗜鹽性。

其中菌株Y171004和Y177002能不同程度地抑制核盤菌的生長。菌株Y171004的分泌物會(huì)引起病原菌絲的皺縮，與申光輝等的研究結(jié)果[12]相似。肉眼觀察抗菌圈周圍的菌絲較疏松;菌株Y177002的分泌物會(huì)引起病原菌絲膨大、變粗且變黑，與顧彪等研究的結(jié)果[13]相似。經(jīng)硫酸銨沉淀耐熱性分析后確定菌株Y171004的抗菌物質(zhì)為熱不穩(wěn)定性蛋白。最終確定抗菌活性部分有待進(jìn)一步研究。

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