陳錦 楊侃侃 官迪

摘要：以野生蝦脊蘭（Calanthe discolor）未成熟蒴果為材料，MS為基本培養(yǎng)基，探討不同光照度、熱激和不同培養(yǎng)基配方對蝦脊蘭種子萌發(fā)、原球莖發(fā)生及植株再生的影響。結(jié)果表明，未完全成熟的種子在1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+20 g/L馬鈴薯+1.0 g/L活性炭培養(yǎng)基中萌芽率最佳;在1 500 lx光照度條件下培養(yǎng)時種子萌發(fā)速率較快。通過黑暗條件下35 ℃熱激5 d有利于已萌動種子脫分化形成原球莖。使用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)原球莖形成胚性愈傷組織效果最好。MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+20 g/L馬鈴薯培養(yǎng)基分化形成植株分化率最高，1/2MS+0.2 mg/L IBA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基則為最佳生根培養(yǎng)基，生根率100%，植株根系發(fā)達(dá)，長勢健壯。該研究建立了蝦脊蘭無菌快繁體系，為保護野生蝦脊蘭資源和種苗人工繁育提供了有效技術(shù)途徑，也為其遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蝦脊蘭;蒴果;原球莖;組織培養(yǎng);植株再生

中圖分類號： Q813.1+2;S682.310.4+3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0045-04

蝦脊蘭[1]（Calanthe discolor L.）為蘭科蝦脊蘭屬多年生草本植物，全屬約150種，我國有51種，大部分為地生種，少數(shù)為附生種植物，其中包括21個特有種，在《中國極瀕危植物名錄》中已全部被列為瀕?；蛞褳l臨滅絕等級。野生蝦脊蘭主要分布在長江以南流域，生于山坡林下[2-3]，是一種價值極高的觀花觀葉植物，也可作為良好的盆栽、地被材料[4]。同時，野生蝦脊蘭也具有一定的藥用價值，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，蝦脊蘭提取物中含有二氫菲、吲哚苷以及一些具有生理活性的生物堿，使得其在傳統(tǒng)中藥中具有抗菌、消炎和抗毒素等功效。李丹平等經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蝦脊蘭的假莖、假鱗莖及根莖具有活血消結(jié)、解毒消腫、止痛等作用[7]。目前，對該物種的報道多限于一些基本生物學(xué)特征[8-9]、果實發(fā)育[10]、胚珠發(fā)育及種子形成[11]、遺傳多樣性[12～14]和天然產(chǎn)物開發(fā)[15-16]等方面，徐剛等通過顯微鏡測定蝦脊蘭屬9種類型的種子發(fā)現(xiàn)，其授粉后1個月形成種胚，5個月后種子才能完全成熟，且與其他難于無菌播種發(fā)芽的蘭科植物如扇脈杓蘭（Cypripedium japonicum）、大花杓蘭（C. macranthum）的種子一樣，胚占種子比例非常小，種胚可見胚皮[17]。為保護這種花藥兩用的珍稀植物，人工繁育研究工作已迫在眉睫。蝦脊蘭種子極小且發(fā)育不完全，在自然條件下萌發(fā)率極低，通常難以存活[18-19]，而它的園藝觀賞性和藥用價值巨大，多年來一直遭到人們過度采挖，導(dǎo)致野生蝦脊蘭資源逐年減少，甚至多個野生資源分布區(qū)已經(jīng)難覓蹤跡?，F(xiàn)在蝦脊蘭屬全屬均被列為瀕危或已瀕臨滅絕等級植物，為保護和開發(fā)蝦脊蘭的種質(zhì)資源并進(jìn)行合理的運用，如何快速繁育出大量幼苗成為人們必須思考的問題。筆者所在的課題組于2015年10月在湘西壺瓶山區(qū)（110°15′E、30°02′N）進(jìn)行湖南省作物資源普查時偶然發(fā)現(xiàn)1株帶有1顆蒴果的野生蝦脊蘭，為了保護野生資源，筆者所在的調(diào)查小組決定留下植株只取下未完全成熟的青色蒴果帶回實驗室。

本研究以野生蝦脊蘭未完全成熟蒴果為材料，探討不同培養(yǎng)基組分及環(huán)境條件刺激對蝦脊蘭原球莖形成的影響，并通過不同培養(yǎng)方式可使原球莖脫分化成為胚性愈傷組織或再分化形成再生植株，隨后誘導(dǎo)生根成苗。本試驗旨在研究促使蝦脊蘭種子形成原球莖的發(fā)生條件及培養(yǎng)基配方，探索一種適合未完全成熟蝦脊蘭種子進(jìn)行組培快繁的技術(shù)體系，通過該方案可快速大量生產(chǎn)蝦脊蘭幼苗。既為蘭科植物原球莖發(fā)生條件探索和胚性愈傷組織誘導(dǎo)提供技術(shù)參考，也對該物種野生資源保護和擴繁提供技術(shù)支撐與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以野生蝦脊蘭20周齡的未成熟蒴果為材料。

1.2 培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件

1.2.1 材料處理 取蝦脊蘭蒴果經(jīng)自來水沖洗30 min;再用75% C2H5OH+0.1% Tween 20消毒90 s;然后在0.1% HgCl2+0.1% Tween 20溶液中浸泡8～10 min，并輕輕振蕩;無菌水沖洗4～6次后在超凈工作臺上將種莢外表面水分風(fēng)干，切開種莢，將種子均勻灑在萌發(fā)不同配方培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度控制為（22±2） ℃，弱光照度為1 500 lx，強光照度為4 500 lx，光照培養(yǎng)時長為12 h/d。

1.2.3 種子萌發(fā) 種子萌發(fā)1號培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+20 g/L馬鈴薯+1.0 g/L 活性炭;種子萌發(fā)2號培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+20 g/L馬鈴薯+1.0 g/L活性炭。種子接入培養(yǎng)基后先放入暗室培養(yǎng)1周待其適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境，再分別給予1 500、4 500 lx 2種不同光照度進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同光照度條件對種子萌發(fā)的影響。

1.2.4 原球莖發(fā)生 種子撒入培養(yǎng)基后開始進(jìn)入吸脹吸水階段，慢慢在培養(yǎng)基養(yǎng)分和植物激素作用下有活力的種子進(jìn)入緩慢吸水階段，酶促反應(yīng)與呼吸作用增強，貯藏物質(zhì)開始分解，胚細(xì)胞的吸水力提高，打破種皮束縛，種子由淡黃色漸漸轉(zhuǎn)色成黃綠色并伴隨著體積膨大。此時即可說明其已經(jīng)開始萌芽，將已萌動的種子轉(zhuǎn)入黑暗條件下35 ℃熱激培養(yǎng)5 d，方法參照文獻(xiàn)[20]，而后繼續(xù)放入1 500 lx弱光下常溫培養(yǎng)，觀察種子發(fā)芽效率和原球莖發(fā)生情況。

1.2.5 原球莖脫分化 將蝦脊蘭原球莖轉(zhuǎn)接至3號培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）、4號培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）、5號培養(yǎng)基（MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）中，觀察不同6-BA濃度對原球莖誘導(dǎo)形成愈傷組織的效果和不定芽發(fā)生情況。

1.2.6 胚性愈傷組織與原球莖分化出芽 將帶有不定芽的愈傷組織和原球莖分別轉(zhuǎn)接至6號固體培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊 脂+30 g/L蔗糖+20 g/L馬鈴薯）、7號固體培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗 糖+20 g/L椰子汁）、8號固體培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+20 g/L香蕉）上進(jìn)行分化培養(yǎng)，觀察不同添加物對愈傷組織和原球莖分化形成再生苗及其生長發(fā)育的影響。

1.2.7 生根培養(yǎng) 將無根的再生植株轉(zhuǎn)接至不同濃度NAA和IBA的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，觀察不同激素濃度對再生植株生根的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基和光照度對種子萌發(fā)的影響

蝦脊蘭種子的萌發(fā)通常需要較長時間，不同培養(yǎng)基組分對種子萌發(fā)效率影響很大。從表1可見，低濃度鹽分培養(yǎng)基和較弱光照條件下培養(yǎng)時最適合蝦脊蘭種子萌發(fā)，即使用1號培養(yǎng)基和1 500 lx光照度培養(yǎng)條件下種子的萌發(fā)效果較好。在培養(yǎng)120 d后該培養(yǎng)條件下的種子慢慢膨大，并漸漸露出黃綠色嫩芽，萌發(fā)率在40%以上。而高濃度鹽分和強光照度培養(yǎng)條件都不利于蝦脊蘭種子快速和高效率萌芽，種子萌發(fā)率會顯著降低，且萌發(fā)時間被延長。將已萌動種子放入35 ℃黑暗條件下熱激培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)入常規(guī)培養(yǎng)條件，隨后種子逐漸膨大發(fā)育成圓潤飽滿的黃綠色小球——原球莖（如圖 1-A）。種子萌動后再經(jīng)過熱激處理均能誘導(dǎo)出原球莖，但不同培養(yǎng)基配方和光照培養(yǎng)條件對種子萌動效率和原球莖誘導(dǎo)品質(zhì)影響較大，若原球莖誘導(dǎo)質(zhì)量不高，在后期進(jìn)行再分化出芽培養(yǎng)時，其容易出現(xiàn)生長緩慢甚至褐化死亡的現(xiàn)象。

2.2 不同培養(yǎng)基對原球莖脫分化和增殖的影響

將長勢良好的原球莖轉(zhuǎn)接至含有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)45 d后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好（圖1-B），愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，生長速度較快，且分布多個不定芽，這有利于后期快速分化出芽，大量培育組培幼苗。當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時，少量原球莖會出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，由1顆原球莖分化增殖形成原球莖團（圖1-C），同時產(chǎn)生大量次生代謝物使培養(yǎng)基褐化。

2.3 不同培養(yǎng)基對愈傷組織和原球莖分化出芽的影響

將愈傷組織和原球莖分別轉(zhuǎn)接至含有不同天然成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后發(fā)現(xiàn)，幾種不同培養(yǎng)基配方都能促使愈傷組織和原球莖分化出芽并形成再生植株（圖1-D），但分化率和幼芽長勢有一定的差異。其中，原球莖含有馬鈴薯和香蕉成分的培養(yǎng)基分化率均較高，且芽苗健壯，含椰子汁的培養(yǎng)基也有較高分化率，但幼苗生長較為緩慢且植株長勢相對細(xì)弱。帶有不定芽的愈傷組織在3種培養(yǎng)基中均能分化形成再生植株，且生長速率差別不大，平均株高低于2 cm，較原球莖誘導(dǎo)的再生植株更為緩慢（表2）。

2.4 生根培養(yǎng)

將分化出幼芽的蝦脊蘭植株轉(zhuǎn)接至以1/2 MS+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+0.1 g/L活性炭為基本成分，同時添加不同濃度NAA和IBA的培養(yǎng)基中進(jìn)行45 d生根培養(yǎng)。表3顯示，NAA和IBA 2種激素都能促使蝦脊蘭愈傷組織根分化，但根分化效率有較大差異。使用NAA生根培養(yǎng)基容易產(chǎn)生氣生根，在NAA濃度為0.5 mg/L時，植株生長旺盛且根系發(fā)達(dá)，具有較好的生根效果;當(dāng)使用濃度達(dá)到1 mg/L時，會誘導(dǎo)根系畸形發(fā)育，形成圓球狀根，不利于養(yǎng)分吸收，從而導(dǎo)致植株生長緩慢。使用IBA生根效果更為理想，根系發(fā)達(dá)且白嫩、健壯，幼苗新葉數(shù)量更多，當(dāng)IBA濃度為0.2 mg/L時，生根效果最佳。生根培養(yǎng)質(zhì)量直接影響后期煉苗移栽成活率，較發(fā)達(dá)健壯的根系有利于移栽后植株快速生出新根汲取水分，減少組培瓶苗移栽后的脫水死亡率。

3 討論與結(jié)論

曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，使用超聲波處理成熟的蝦脊蘭種子后，可大大提高其萌發(fā)率[21]。閔子揚等通過熱激培養(yǎng)南瓜未授粉子房可促使其出胚，并得到再生單倍體植株[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，在蝴蝶蘭葉片外植體培養(yǎng)初期進(jìn)行熱激處理可誘導(dǎo)抗氧化酶活性顯著提高，從而減輕培養(yǎng)過程中蝴蝶蘭褐變的發(fā)生[22]。而王懷宇早在研究中指出，蘭科植物因種類不同而萌發(fā)率差異巨大，還存在未成熟種子萌發(fā)率反而更高的現(xiàn)象[23]。故不能簡單認(rèn)為，種子的成熟度與其萌發(fā)率呈正相關(guān)性，當(dāng)種子成熟到一定程度后，不會再隨著成熟度增加而提高萌發(fā)率，甚至有可能會降低萌發(fā)率或延長萌發(fā)時間[24-25]?？梢?，通過不同物理刺激未成熟種子可能會改變其發(fā)育、分化過程，本研究受客觀條件限制所取材料為未成熟蒴果，而此情況在珍貴野生資源調(diào)查和保護工作中時常遇見，只能使用未完全成熟的種子進(jìn)行播種并誘導(dǎo)萌發(fā)，通過環(huán)境刺激誘導(dǎo)萌動種子分化形成原球莖。研究發(fā)現(xiàn)，使用低濃度鹽分的培養(yǎng)基和較弱光照培養(yǎng)有利于蝦脊蘭種子萌發(fā)，當(dāng)光照加強時，種子萌發(fā)率大大降低，甚至不萌發(fā)，可見是強光照不利于解除種子休眠。在乳白色種子解除休眠漸漸變綠后采用一定外界環(huán)境刺激，有利于促進(jìn)不成熟種子繼續(xù)分化發(fā)育，膨大形成胚性組織。若無熱激刺激，而繼續(xù)暗光培養(yǎng)時間過長易引起種子褐化死亡。光照程度對蝦脊蘭的分化、發(fā)育過程有明顯影響，當(dāng)萌芽和需要進(jìn)行脫分化使之成為胚性組織時需要弱光甚至黑暗處理，弱光下有利于分化出蓬松的淡黃色愈傷組織，而當(dāng)須要再分化出芽和植株生長時使用較強光照更加合適，強光照有利于誘導(dǎo)出更多叢生芽，植株長勢也更加粗壯，根系發(fā)達(dá)。種子萌動過程中會出現(xiàn)部分褐化死亡的現(xiàn)象，可能是培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不適合蝦脊蘭萌發(fā)，亦或是種子成熟度不夠造成萌動后的種子停止了進(jìn)一步發(fā)育。蝦脊蘭種子萌動后肉眼可見其呈淡黃綠色，熱激5 d后萌芽種子可發(fā)育成原球莖而不繼續(xù)發(fā)生胚芽、胚軸和胚根。待原球莖長至肉眼清晰可辨約1 mm大小之后轉(zhuǎn)入含有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，在高濃度6-BA且暗室培養(yǎng)條件下原球莖會不斷膨大形成淡黃色的瘤狀胚性愈傷組織，這些愈傷組織膨大后進(jìn)入強光培養(yǎng)可以分化出大量不定芽，將這些不定芽分割開來并進(jìn)行分化培養(yǎng)，可形成大量幼苗，比直接通過原球莖分化出苗的增殖效率更高，可做到真正意義上的通過組織培養(yǎng)進(jìn)行無限制培育組培幼苗。但當(dāng)6-BA使用濃度較低時，原球莖不會被誘導(dǎo)形成愈傷組織而是直接發(fā)育形成單棵無根植株。

蘭科植物在我國藥用植物資源中占有重要地位，種類繁多且資源豐富[26-27]，但近年來的環(huán)境破壞和無節(jié)制私挖亂采已造成多數(shù)藥用蘭科植物頻臨滅絕，由于野生資源逐漸枯竭，人們開始研究如何人工栽培和繁育。本研究為未成熟蝦脊蘭種子組培快繁和蘭科植物原球莖誘導(dǎo)發(fā)生條件進(jìn)行了一系列探索，為蝦脊蘭屬植物保護工作提供借鑒和理論支持，也為日后蝦脊蘭種苗繁育工作排除技術(shù)障礙。

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