楊利利，藍(lán)夢柳，陳國翔，許 文，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

澤瀉（Alismatis Rhizoma）來源于澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉［Alisma orientale（Sam.）Juzep.］的干燥塊莖，其性寒，味甘，具有利濕、清熱、化濁降脂等功效［1-2］。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，澤瀉具有利尿［3］、降血糖［4］、降血脂、抗脂肪肝［5］及動脈粥樣硬化［6］、抗腫瘤［7］等藥理作用。澤瀉主產(chǎn)地為福建、江西廣昌、四川等地，作為福建的道地藥材，以其生產(chǎn)歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)良而被列為上品［8-9］。根據(jù)調(diào)研發(fā)現(xiàn)澤瀉花苔（澤瀉的花莖）常被當(dāng)?shù)鼐用裼脕硎秤?。美國學(xué)者Harman在1956年提出自由基學(xué)說，認(rèn)為生物體內(nèi)的多種代謝途徑都會產(chǎn)生高度氧化活性的自由基，自由基生成和消除通常處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體自由基過剩時，就會直接或者間接造成細(xì)胞活力下降，引起機(jī)體衰老、誘發(fā)細(xì)胞癌變等各種疾?。?0］。因此，抗氧化劑能夠減少自由基對機(jī)體氧化損傷，有效抑制疾病的發(fā)生，而現(xiàn)代藥理研究表明澤瀉塊莖具有抗氧化活性，但是對澤瀉不同部位，尤其澤瀉花苔體外抗氧化活性的評價研究未見報道。因此，為了解澤瀉塊莖、花苔、莖、葉等不同部位的抗氧化活性，本研究通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除法和鐵離子還原法（FRAP）［11-12］對比分析澤瀉不同部位提取物的體外抗氧化效果，以期為澤瀉花苔資源藥食兩用功能開發(fā)提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 ME204E／02電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（帝肯奧地利有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 ABTS試劑、FRAP試劑（碧云天生物技術(shù)）；S30629 DPPH（上海源葉生物科技有限公司）。原材料澤瀉10批樣品采自福建建甌的吉陽，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級實驗師鑒別基原為［Alisma orientale（Sam.）Juzep.］，樣本寄存于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。澤瀉洗凈，分為塊莖、莖、葉、花苔不同部位，60℃烘干，粉碎后過80目，備用。

2 實驗方法

2.1 樣品制備 精密稱取1 g樣品粉末置于50 mL的錐形瓶中，加入25 mL甲醇，密封，稱重。超聲（250 W，40 kHz）提取 30 min。用甲醇補(bǔ)足失重，0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 清除DPPH自由基 精密稱取DPPH粉末適量，加入甲醇溶解制成50 μg／mL的DPPH溶液，避光保存。在96孔板中加入100 μL DPPH溶液，再分別加入不同濃度的樣品液及VC標(biāo)準(zhǔn)品，最后加甲醇至每個檢測孔為200 μL，避光30 min。另將DPPH溶液換為甲醇溶液，重復(fù)上述操作，以甲醇做空白對照。利用多功能酶標(biāo)儀測定519 nm處的A值，計算清除率和IC50值。

As：樣品＋DPPH溶液；Ab：樣品＋甲醇溶液；Ac：DPPH 溶液；Ab'：甲醇溶液

2.2.2 清除ABTS自由基 取等體積ABTS溶液和氧化劑溶液混合，室溫避光保存16 h，得ABTS工作母液。用80%的無水乙醇稀釋ABTS工作母液，使其在734 nm處的吸光度為0.65～0.75，相應(yīng)的405 nm處的吸光度在1.4左右。在96孔板中加入100 μL ABTS工作液，再分別加入不同濃度的樣品液及VC標(biāo)準(zhǔn)品，最后加甲醇至每個檢測孔為200 μL，室溫下孵育6 min。利用多功能酶標(biāo)儀測745 nm處的A值，計算清除率和IC50值。

A1：樣品的 A 值；A2：空白對照；A0：ABTS 工作液的A值

2.2.3 FRAP法測抗氧化能力 取TPTZ溶液、TPTZ稀釋液、檢測緩沖液按1∶10∶1的比例混勻，放入37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱孵育5 min。在96孔板中，加入100 μL已配制好的FRAP工作液，再分別加入不同濃度的樣品液、FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液及VC標(biāo)準(zhǔn)品，最后加甲醇至每個檢測孔為200 μL，室溫下孵育5 min。利用多功能酶標(biāo)儀測593 nm處的A值，以A值對不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲計算總抗氧化能力。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理書局。所得實驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗結(jié)果的均值，數(shù)據(jù)用（）表示。

3 結(jié) 果

3.1 清除DPPH自由基 澤瀉不同部位對DPPH自由基均有一定清除作用，在實驗濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大。澤瀉各個部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖。見表1。

3.2 清除ABTS自由基 澤瀉不同部位對ABTS自由基均有一定清除作用，在實驗濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大。澤瀉各個部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉葉＞澤瀉莖＞澤瀉塊莖。見表2。

表2 澤瀉不同部位對ABTS自由基清除率%

3.3 FRAP法測抗氧化能力 以A值對不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝0.005 1 X＋0.064 6，r＝0.999 3，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算澤瀉不同部位的FRAP值。澤瀉各個部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖。見表3。

表3 澤瀉不同部位的FRAP值

3.4 澤瀉不同部位抗氧化能力比較 IC50值是清除率為50%時的濃度值，由SPSS 20.0計算各個樣品的IC50值，結(jié)果如表4所示，IC50值越小，表明其抗氧化能力越強(qiáng)。FRAP法結(jié)果總抗氧化能力用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示，F(xiàn)RAP值越大抗氧化能力越強(qiáng)。

4 討 論

本研究通過DPPH法、ABTS法和FRAP法三種抗氧化能力檢測方法比較，測定澤瀉不同部位對DPPH自由基、ABTS＋自由基的清除率及Fe3＋的還原能力，從而對澤瀉花苔、澤瀉塊莖、澤瀉莖、澤瀉葉的抗氧化能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明抗氧化能力隨著濃度的升高而提高，且澤瀉不同部位對DPPH、ABTS自由基和Fe3＋表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。在DPPH自由基清除實驗中，澤瀉各個部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖，在ABTS自由基清除實驗中，澤瀉各個部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉葉＞澤瀉莖＞澤瀉塊莖，在FRAP法測抗氧化能力實驗中澤瀉各個部位抗氧化能力大小依次為澤瀉花苔＞澤瀉莖＞澤瀉葉＞澤瀉塊莖。

表4 澤瀉不同部位的IC50值及FRAP值

澤瀉地上部分相較于塊莖均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，澤瀉花苔的抗氧化活性在3種檢測方法中均有最強(qiáng)的抗氧化能力，提示澤瀉花苔有一定的藥用價值，具有很好的開發(fā)前景，值得深入研究。