羅斌漢，潘 紅，岑曼益，趙睿明，孫雨琪，羅千慧，侯俊達，王波波，藺國珍*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130000）

動物寄生蟲病是僅次于傳染病的一大類疫病，由于存在土源性感染，因此在自然放牧的過程中，大部分動物均呈不同程度的感染。然而，目前主要依賴于化學驅蟲藥的使用，來控制動物寄生蟲病的發(fā)展。但是，隨著長期大量的使用化學驅蟲藥物，造成了一系列的問題，如化藥殘留、環(huán)境污染、耐藥蟲種的出現(xiàn)等[1,2]。因此，人們就去尋找一種能夠補充或替代傳統(tǒng)藥學驅蟲藥，來進一步更好地防治動物寄生蟲。因此，利用食線蟲真菌與寄生線蟲存在的生物拮抗作用，來進一步防控家養(yǎng)動物寄生線蟲病的發(fā)展。其中，Duddingtonia flagrans是一種能夠形成捕食器官的食線蟲性真菌，該菌本身在自然界中就作為線蟲的天敵而存在。該菌在生長發(fā)育的后期，能夠產生大量的具有雙層厚壁的孢子（厚垣孢子），該孢子不同于其它食線蟲真菌所產生的分生孢子，它們抗逆性極強，能夠通過動物消化道后仍然能保持活性[3-7]。目前D. flagrans作為胃腸道線蟲生物防制的菌種，已在實驗室階段和田間條件下對綿羊、山羊、牛、馬等動物進行了體內通過消化道試驗已經證明對減少糞便中L3的數(shù)量是有效的[8,9]。然而，該菌在生長發(fā)育的過程中，環(huán)境中相對濕度和培養(yǎng)時間對其產孢量的影響至今仍不可知。

本研究的目的是探索該菌株在生長發(fā)育的過程中，隨著培養(yǎng)時間的延長及環(huán)境中相對濕度對該菌的產孢量的影響，旨在獲得該分離株最大產孢量的條件，為將來該菌株應用于家養(yǎng)動物寄生線蟲生物防治制劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

食線蟲真菌D. flagrans分離株（SDH035），由西北民族大學蔡葵蒸教授課題組提供，菌株在4 ℃下2%玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基保存。

1.2 培養(yǎng)基及其制備

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：按照1.5 %～2 %濃度稱取瓊脂粉于三角燒瓶中，加入蒸餾水，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺內完成倒制平板培養(yǎng)基，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

麩皮瓊脂培養(yǎng)基（WBA）：8%麩皮原液的制備：稱量80 g麩皮，量取1 000 ml蒸餾水，加熱保持微沸狀態(tài) 1 h，經6層紗布過濾后，置于2 000 ml量筒內，并補足至1 000 ml，采用保鮮膜封口置于4℃冰箱靜置過夜，吸取上清液，稀釋至所需濃度，再加入1.5%～2 %的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺內完成倒制平板培養(yǎng)基，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

麩皮培養(yǎng)液：按照上述方法制備濃度為8%的麩皮原液，稀釋至2%濃度，121 ℃高壓滅菌20 min，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

產孢培養(yǎng)基：糧食培養(yǎng)基的總重量為120 g，主要成分是玉米和小麥，其比例是2：1，按照比例稱取小麥和玉米放入500 ml錐形瓶加入1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4以及適量的蒸餾水，糧食與蒸餾水的比例是1.5：1，用硅膠塞蓋住并用牛皮紙將其瓶口包好，121 ℃高壓滅菌30 min，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器設備

超凈工作臺；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZP—250 型）；光學顯微鏡（Leica DME 型）；倒置顯微鏡（Leica）；解剖針；錐形瓶；燒杯；研缽；漩渦振蕩儀；高速離心機等。

1.4 厚垣孢子的生產

在超凈工作臺內，用2%玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基保存的菌株，在無菌環(huán)境下挑取少量菌絲，接種于WA平板中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d結束培養(yǎng)。用滅菌過的打孔器切取4 mm×4 mm大小含有菌絲的瓊脂塊，置于2%液體培養(yǎng)基中，每瓶8塊，置于振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/ min，相對濕度分別設為35%和85%，28 ℃培養(yǎng)7 d后終止培養(yǎng)。上述培養(yǎng)物置于旋渦震蕩儀中反復振蕩10 min，按5%接種量將菌液接種至產孢培養(yǎng)基內，置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)分別培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d。培養(yǎng)結束后，隨機抽取5 g不同培養(yǎng)時間段的谷粒培養(yǎng)物，然后用0.05%（w）的滅菌Twain-80水將生長在谷粒表面的菌物洗脫下來，用雙層紗布過濾，獲得含有厚垣孢子的菌懸液，用血細胞計數(shù)版對其孢子進行計數(shù)，最后推算出每克谷粒產生的厚垣孢子數(shù)量。

2 結果

表1表明D. flagrans分離株在兩種相對濕度、不同培養(yǎng)時間段的產孢量。從表1可知，在相同的培養(yǎng)時間下，85%的相對濕度所獲得的產孢量顯著高于35%的相對濕度。

圖1顯示了食線蟲真菌D. flagrans分離株分別在35%的相對濕度下，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所獲得的產孢量。結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，該菌株的產孢量逐漸升高，當培養(yǎng)時間為7～14 d時，產孢量緩慢上升，此后產孢量急速增加，在培養(yǎng)28 d后該菌株的產孢量趨于平緩，培養(yǎng)至49 d時其產孢量達到高峰。

圖2顯示了食線蟲真菌D. flagrans分離株分別在85%的相對濕度下，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所獲得的產孢量變化趨勢。

表1 Duddingtonia flagrans分離株在兩種相對濕度、不同培養(yǎng)時間段的產孢量

圖1 食線蟲真菌Duddingtonia flagrans分離株在不同培養(yǎng)時間段（相對濕度為35%）的產孢量

3 討論

圖2 食線蟲真菌Duddingtonia flagrans分離株在不同培養(yǎng)時間段（相對濕度為85%）的產孢量

本研究通過對食線蟲真菌D. flagrans分離株分別在35%和85%的相對濕度下，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后獲取其厚垣孢子，并對其產孢量進行計數(shù)。研究結果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，該菌株的產孢量逐漸升高，當培養(yǎng)時間為7～14 d時，產孢量緩慢上升，此后產孢量急速增加，在培養(yǎng)28 d后該菌株的產孢量趨于平緩，培養(yǎng)至49 d時其產孢量達到高峰。此外，該分離株分離株分別在35%的相對濕度下，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所獲得的產孢量均顯著低于85%的相對濕度所獲得的產孢量。說明，該分離株在相對濕度較高的條件下更易于產生厚垣孢子。若在培養(yǎng)的過程中，環(huán)境中的相對濕度較低，將會直接影響該菌產生厚垣孢子的產量。