陸婧婧,宋 月,岳瑩雪,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

肥胖是一種慢性代謝疾病,并且已經(jīng)成為全球流行性疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,截止到2016年,全球已有19億成年人超重,其中6.5億人肥胖,超過3.4億名兒童和青少年超重或肥胖[2]。就目前快節(jié)奏的生活方式而言,高能量食物的攝入與久坐的工作方式是導(dǎo)致肥胖率升高的主要原因。當(dāng)攝入過多脂肪時,會被各種酶及膽汁酸鹽進(jìn)行消化水解成甘油和脂肪酸等進(jìn)入血液,而肝臟作為脂肪合成的主要場所,如果合成的甘油三酯不能被及時轉(zhuǎn)運就會形成脂肪肝、脂肪組織積累,此外還會引起二型糖尿病、心血管疾病等慢性代謝疾病的發(fā)生[3]。目前,有很多減肥藥物出現(xiàn)在大眾的視野中,如可以抑制食欲的西布曲明,阻擋脂類吸收的奧利司他等藥物,但會使得體內(nèi)所需脂溶性維生素吸收不足引起內(nèi)分泌失調(diào)[4]。所以,研發(fā)出更加新型健康的制劑來預(yù)防肥胖形成至關(guān)重要。

世界衛(wèi)生組織將益生菌制劑定義為,可以黏附、定植在腸道表面,當(dāng)達(dá)到有效數(shù)量級時,對宿主產(chǎn)生有益的作用[5]。Yung-Tsung Chen[6]研究得出,馬里乳桿菌ASP1的攝入可以調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠體內(nèi)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá),減少甘油三酯的積累,進(jìn)而緩解肥胖。Kyung-Ah Kim[7]表明,LactobacillusbrevisOK56通過抑制炎癥因子NF-κB的表達(dá)進(jìn)而緩解小鼠肥胖的形成。Cuiyuan Jin[8]研究得出,無菌小鼠和正常小鼠同時飼喂高脂飼料,正常小鼠成為肥胖模型,而無菌小鼠無肥胖特征,說明肥胖的形成與腸道菌群密切相關(guān)。很多實驗表明[9-10],肥胖小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門與擬桿菌門比值增大,而益生菌制劑的補充使腸道內(nèi)厚壁菌門下降,擬桿菌門上升,改善腸道菌群結(jié)構(gòu),進(jìn)而緩解肥胖的形成。目前,很多的研究多關(guān)注一株益生菌對肥胖形成的緩解作用,兩株及多株益生菌聯(lián)合是否具有更好的調(diào)節(jié)作用仍值得進(jìn)一步研究。

植物乳桿菌KLDS1.0344、植物乳桿菌KLDS1.0386分離于內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳和稀奶油中,已經(jīng)證明兩株菌具有較好的耐酸膽鹽、黏附特性,且具有較優(yōu)的降解膽固醇能力[11-13]。本實驗采用兩株植物乳桿菌聯(lián)合灌胃,檢測其對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖所產(chǎn)生的抑制作用。為開發(fā)出具有緩解肥胖形成的功能性發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌KLDS1.0344、植物乳桿菌KLDS1.0386 教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心;C57BL/6J雄性小鼠 60只,體重20～23 g,許可證號:SCXK(京)2012-0001,北京維通利華實驗技術(shù)有限公司;高脂飼料D12460、對照飼料D12450B配方參照文獻(xiàn)配方[14];MRS培養(yǎng)基 每1L含有:蛋白胨5 g、牛肉膏5 g、胰蛋白胨10 g、乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、葡萄糖20 g、硫酸錳0.25 g、檸檬酸氫二銨2 g、吐溫-80 g,澳博星生物技術(shù)公司;酵母粉、奧利司他 OXOID公司。

VD-1320超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司;DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HVE-50全自動高壓滅菌鍋 HIRAYAMA公司;紫外可見分光光度計 MILTON ROY COMPANY;GL-21M離心機 上海市離心機械研究所;DH-101-3BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗樣品的制備 實驗前菌株KLDS1.0344和KLDS1.0386分別以2%接種量接種到MRS培養(yǎng)基中,傳代3次,取培養(yǎng)16 h的菌懸液,6000 r/min、10 min離心收集菌體,加入5 mL無菌PBS緩沖溶液,利用移液槍吹散菌體,繼續(xù)離心,重復(fù)兩次,第三次收集兩株菌體,用PBS重新懸浮成濃度為108CFU/mL的菌懸液,劑量選擇參照靳妲等的研究[15]。菌懸液每日重新制備。奧利司他藥物組按每千克小鼠體重10 mg劑量灌胃[16]。

1.2.2 小鼠分組與飼養(yǎng) 所有小鼠進(jìn)行普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,后隨機分為四組,每組十只:空白組、模型組、干預(yù)組(KLDS1.0344組、KLDS1.0386組、混合組)藥物組?？瞻捉M喂食D12450B飼料,其余組菌喂食D12460飼料?？瞻捉M和模型組灌胃滅菌0.01 M PBS溶液,干預(yù)組和藥物組分別灌胃菌懸液(其中KLDS1.0344組、KLDS1.0386組分別灌胃兩株菌株,混合組按照1∶1比例,每株菌為5×108CFU/mL,每次每只小鼠灌胃0.2 mL)和奧利司他溶液(10 mg/kg),連續(xù)灌胃6周。鼠房溫度保持在24 ℃左右,濕度保持在45%～50%之間,照明10 h左右。實驗期間,每周更換兩次墊料,每天更換高脂飼料以免脂肪氧化產(chǎn)生氣味影響小鼠進(jìn)食,每周進(jìn)行體重測量。

1.2.3 小鼠體重、Lees系數(shù)、體脂率的測定 每周記錄小鼠體重變化;測定小鼠體長(從鼻尖到肛門的距離),計算Lees系數(shù);取出小鼠附睪脂肪組織及腎周脂肪組織進(jìn)行稱量[17]。

1.2.4 血脂四項測定 小鼠眼球取血,室溫放置2 h,4 ℃,3000 r/min離心10 min,吸取血清,送至黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)利用全自動生化分析儀檢測血清中TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)和HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)的濃度。

1.2.5 小鼠臟器指數(shù)測定 小鼠眼球取血后,進(jìn)行解剖,將小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟取出,用無菌PBS沖洗,并用濾紙吸干,稱重,進(jìn)行臟器指數(shù)的測定。

1.2.6 肝臟中甘油三酯的測定 取出凍藏在-80 ℃的各組小鼠肝臟,分別稱取0.1 g,按1∶9的比例加入滅菌PBS冰浴條件下進(jìn)行研磨,4 ℃,4000 r/min離心10 min,取出上清液,利用南京建成甘油三酯試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.7 肝臟HE病理學(xué)分析 取空白組、模型組、干預(yù)組及藥物組小鼠的肝臟,觀察顏色和形態(tài)所發(fā)生的變化,稱取不同肝臟同一部位,放置在4%的甲醛溶液中,于30 ℃恒溫固定,進(jìn)行HE染色,參照宋晨實驗方法[18],在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟病理變化,并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

表1 體重增量、Lees系數(shù)、體脂率Table 1 The body weight,weight gain,Lees coefficient,and body fat percentage

注:同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，表2同。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重、Lees系數(shù)、體脂率的分析

8周末,如圖1所示,模型組小鼠體重高于空白組27.5%,大于20%[18],肥胖模型建立,說明高脂飲食會增加機體對能量的攝入從而使體重顯著增加(P<0.05)。如表1所示,模型組小鼠體重增量最大,而混合組與藥物組體重增量明顯低于模型組(P<0.05),二者處于相同水平,說明混合組能和藥物組一樣有效的抑制高脂誘導(dǎo)小鼠體重的增長。

圖1 小鼠體重的變化Fig.1 Changes in body weight of mice

Lees系數(shù)反映小鼠的肥胖程度,數(shù)值越大,肥胖程度越高。從表1可以看出,模型組的Lees系數(shù)大于空白組,說明高脂飲食能引起小鼠的快速增長并引起肥胖;混合組和藥物組系數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。

肥胖的形成不僅需要觀測體重的變化,也應(yīng)關(guān)注體內(nèi)脂肪含量的變化,體脂率是體內(nèi)脂肪含量與體重的比值,可以更加直觀地觀測到小鼠的肥胖程度。從表1可以看出,模型組的體脂率顯著高于其他三組(P<0.05),混合組和藥物組顯著降低了體脂率(P<0.05),與體重及Lees系數(shù)結(jié)果一致。

2.2 血脂四項的變化

長期高脂膳食的攝入,會造成體內(nèi)產(chǎn)生過多的脂肪酸,從而促進(jìn)了血清中TG和TC含量上升,若機體處于肥胖狀態(tài)時,體內(nèi)脂肪酶會加速處理,使得HDL含量下降,LDL含量升高。

血脂四項變化如圖2所示,與空白組相比,模型組小鼠TG、TC、LDL的含量均顯著上升(P<0.05),HDL的含量顯著降低(P<0.05)。當(dāng)灌胃KLDS1.0344與KLDS1.0386進(jìn)行干預(yù)時,均在不同程度上獲得了改善。與模型組相比,KLDS1.0386組和混合組均能有效改善高脂飲食引起血清中TG水平的增加,混合組效果更為明顯(P<0.05)。供試菌株的干預(yù)均能有效緩解血清中TC的增加(P<0.05),使得HDL的含量明顯上升(P<0.05)。此外,混合組的指標(biāo)更接近于對照組與藥物組,所以混合組可以顯著的改善高脂飲食所引起的血脂升高。這與姚芳芳等[19]研究結(jié)果相符合,副干酪乳桿菌N1115聯(lián)合益生元能有效改善高脂飲食所引起的小鼠血清甘油三酯、膽固醇的下降。可能由于益生菌的干預(yù)改善了其腸道菌群結(jié)構(gòu),使腸道通透性改變,抑制對高脂飲食的吸收。Bobae[20]實驗結(jié)果表明,高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠同時灌胃鼠李糖乳桿菌LGG(1×108CFU/只),可以有效緩解小鼠血清中TG和TC水平的增加。

圖2 小鼠的血脂四項Fig.2 The blood lipids of mice注:小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 臟器指數(shù)的測定

由表2可以看出,長期高脂飲食對小鼠肝臟影響較為顯著(P<0.05),對心臟、脾臟、腎臟無顯著影響(P>0.05)。說明高脂飲食可能會引起小鼠肝臟脂肪性病變,嚴(yán)重則會導(dǎo)致脂肪肝,不同實驗處理對小鼠的心臟、脾臟、腎臟未產(chǎn)生影響。

2.4 肝臟中甘油三酯含量的測定

肝臟是甘油三酯合成的主要場所,當(dāng)所合成的甘油三酯過多,不能被及時轉(zhuǎn)運時,便會在肝臟中積累。由圖3可知,長期飼喂高脂飼料可引起肝臟中脂肪的積累,模型組肝臟中甘油三酯含量顯著上升(P<0.05),灌胃植物乳桿菌干預(yù)組中甘油三酯含量明顯得到了改善(P<0.05),且混合組效果較好。與張震研究結(jié)果一致[22],其利用鼠李糖乳桿菌干預(yù)高脂飲食小鼠,結(jié)果表明可以有效改善小鼠肝臟中的甘油三酯含量。Yooa[21]實驗結(jié)果表明,L.plantarumKY1和L.curvatusHY7601干預(yù)高脂飲食小鼠9周,可以有效緩解肝臟中甘油三酯含量,緩解非酒精性脂肪肝的形成。

表2 小鼠的臟器指數(shù)(%)Table 2 Organ index of mice(%)

圖3 小鼠肝臟中甘油三酯的含量Fig.3 Content of triglyceride in liver注:小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 肝臟病理切片HE染色

肥胖與脂肪肝關(guān)系密切,肥胖常常會引起脂肪肝的形成。在肝臟中,如果甘油三酯合成和分解保持平衡,則不會有脂滴形成,一旦有過多脂質(zhì)累積,則會在細(xì)胞內(nèi)形成圓形的脂滴,破壞肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu),對肝臟造成損傷,當(dāng)脂肪空洞數(shù)量及大小達(dá)到一定程度,就會形成脂肪肝[18]。從圖4中,可以觀察到對照組(Control)中無脂肪變性,組織結(jié)構(gòu)清析、完整,未發(fā)生病變。模型組(Model)肝臟中出現(xiàn)小而多的脂肪空洞,呈規(guī)則的圓形,說明高脂飲食在引起肥胖的同時,攝入的甘油三酯不能被充分利用,積累在肝臟引起輕度脂肪肝的形成。而經(jīng)過乳酸菌干預(yù),KLDS1.0344組中出現(xiàn)部分大脂滴,KLDS1.0386組出現(xiàn)小的脂滴,混合組(MX)肝臟中脂肪變性減輕,脂肪空洞很小且很少,說明混合組能有效降低機體對脂肪的積累,這可能是因為益生菌的干預(yù)促進(jìn)了機體脂代謝,從而減少脂質(zhì)積累;藥物組所體現(xiàn)較好的治療效果,阻止了體內(nèi)對脂肪的吸收,導(dǎo)致肝臟中甘油三酯含量降低。這與宋晨[18]研究結(jié)果一致,益生菌干預(yù)顯著的改善了高脂飲食所引起的脂肪肝,使肝臟中脂肪空洞變少變小。

圖4 小鼠肝臟組織切片HE染色Fig.4 Liver HE staining of mice注:箭頭所標(biāo)記為脂肪變性形成的圓形空洞。

3 討論

乳酸菌因其具有較好的耐酸耐膽鹽特性,及腸道黏附定植特性,已經(jīng)廣泛用來治療人體或者動物腸道相關(guān)疾病。本實驗采取高脂飲食同時灌胃兩株植物乳桿菌,8周末,檢測肥胖相關(guān)指標(biāo)。在體重體脂方面,模型組小鼠體重均達(dá)到31.2 g,混合組小鼠達(dá)到26.69 g,得出益生菌混合組能顯著的降低高脂飲食所引起的肥胖(P<0.05);模型組小鼠體脂率為3.12%,混合組小鼠為2.33%,可以有效的減少小鼠脂肪的積累,這與李麗[23]研究結(jié)果一致,乳桿菌的干預(yù)會顯著降低高脂飲食小鼠體內(nèi)的體重及體脂率。與模型組小鼠相比,混合組小鼠血清中甘油三酯含量下降了33.3%,肝臟甘油三酯含量下降了34.2%,存在顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義,這與李明月[24]研究結(jié)果相似,LactobacilluscaseiYBJ02干預(yù)后使得小鼠血清和肝臟中甘油三酯含量下降了27%、30.3%。通過肝臟切片可以得出,與模型組相比,混合組切片中脂肪空洞較小,而且密度較低,存在顯著性差異(P<0.05)。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明,植物乳桿菌KLDS1.0344與植物乳桿菌1.0386聯(lián)合制劑,可以顯著降低小鼠體內(nèi)甘油三酯含量,減緩脂肪肝的形成,減少脂肪組織的累積,從而有效地抑制高脂飲食所引起的肥胖。為開發(fā)出具有緩解肥胖的發(fā)酵劑奠定了基礎(chǔ),在未來的研究中我們可以進(jìn)一步探討兩株菌對脂肪合成、代謝相關(guān)基因及通路的影響。