,2,*

(1.吉林化工學院化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022;2.吉林大學化學學院,吉林長春 130000)

山刺玫屬于喜光的薔薇科小灌木,主要生長在雜木林及山坡灌木中,其果實稱為刺玫果,廣泛分布于東北及內(nèi)蒙、山西等省[1]。山刺玫富含黃酮類[2]、鞣質(zhì)類[3]、皂苷類[4]、總?cè)扑醄5]等活性成分。其所含總黃酮類具有減慢心率、抑制離體心房收縮[6]、延長凝血時間、抑制血栓形成的作用[7],可用于預(yù)防和治療高血脂、血栓所致的心腦血管疾病[8]。

現(xiàn)階段對刺玫果的研究主要集中于其自身所含物質(zhì),并無太多拓展。當代食品的開發(fā)與利用多結(jié)合新型技術(shù)來實現(xiàn)綠色食品的生產(chǎn)與經(jīng)營,故本文利用黃酮類化合物具有較高的超離域度、完整的大π鍵共軛體系、強配體氧原子與合適的空間構(gòu)型,可與金屬離子形成良好的螯合物這一特性,得到新的黃酮絡(luò)合物。配位化合物是一類由配體和中心金屬原子以配位鍵結(jié)合,按一定的組成和空間構(gòu)型所形成的化合物。金屬絡(luò)合物在生命過程中起著十分重要的作用,這可以作為新食品研制的一個重要方向,從而得到更加優(yōu)良的新型食物[9-10]。這為刺玫果的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺玫果總黃酮 實驗室自制;蘆丁標準品 成都曼思特生物科技有限公司;D-101大孔樹脂 西安藍曉科技新材料股份有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TU-19紫外-可見光光度分析儀 北京普析通用儀器有限責任公司;FA2004N噴霧干燥器 上海精密科學股份有限公司;H1850離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;W5-100SP型恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺玫果總黃酮的制備 稱取刺玫果干粉適量,加入6倍量的75%乙醇水溶液,于85 ℃條件下加熱回流3次,每次5.0 h[11],制得粗提物。再通過D-101大孔樹脂,加入上柱液濃度為0.025 g/mL(相當于原生藥),上樣量0.24 g/g(生藥量:樹脂量),體系pH為2.0～4.0,樹脂徑高比為1∶3,先靜置30 min,然后以1 BV/h流速進行吸附,之后用3 BV蒸餾水以3 BV/h進行洗脫,再用4 BV的70%乙醇水溶液以1 BV/h的流速洗脫[12],制得刺玫果總黃酮。

1.2.2 樣品中總黃酮含量的檢測 稱取刺玫果精提物0.16 g,用60%乙醇溶液定容至250 mL容量瓶中,過濾,取續(xù)濾液1 mL于25 mL容量瓶中,在30 ℃水浴下,加入5% NaNO2溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加4% NaOH溶液10 mL,再加入60%乙醇溶液,定容,放置15 min,以不加顯色劑的供試液為空白,于505 nm處測吸光度A。根據(jù)以蘆丁為對照品,得到標準曲線A=11.868C+0.0035,R2=0.9994(A為吸光度值,C為蘆丁質(zhì)量濃度mg/mL),并計算樣品中的總黃酮含量[12]。

1.2.3 刺玫果總黃酮Zn2+絡(luò)合物的制備

1.2.3.1 單因素實驗 氯化鋅濃度的影響：稱取干燥的刺玫果總黃酮適量，甲醇溶解，定性濾紙過濾，配制成總黃酮質(zhì)量濃度為4 mg/mL的供試品溶液各50 mL，置于6個具塞錐形瓶中，在25 ℃下，邊攪拌邊緩慢加入質(zhì)量濃度分別為4、6、8、10、12、14 mg/mL氯化鋅溶液25 mL，用4% NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7，以30 r/min的頻率恒溫振蕩2.0 h，10000 r/min離心10 min，測定上清液中總黃酮質(zhì)量濃度，收集沉淀得到刺玫果總黃酮Zn2+絡(luò)合物，根據(jù)反應(yīng)前后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度計算黃酮轉(zhuǎn)化率。

pH的影響：以最優(yōu)氯化鋅濃度進行試驗，其他條件同上，考察pH分別為6、7、8、9、10、11對黃酮轉(zhuǎn)化率的影響。

總黃酮溶液質(zhì)量濃度的影響：以最優(yōu)氯化鋅濃度、pH進行試驗，其他條件同上，考察總黃酮溶液質(zhì)量濃度4、6、8、10、12、14、16 mg/mL對黃酮轉(zhuǎn)化率的影響。

溶劑的影響：以最優(yōu)氯化鋅濃度、pH、總黃酮溶液質(zhì)量濃度進行試驗，其他條件同上，考察分別用甲醇、30%、50%、70%、95%乙醇、無水乙醇溶解刺玫果總黃酮對黃酮轉(zhuǎn)化率的影響。

反應(yīng)溫度的影響：以最優(yōu)氯化鋅濃度、pH、總黃酮溶液質(zhì)量濃度、溶劑進行試驗，其他條件同上，考察不同反應(yīng)溫度25、40、60、80、95 ℃水浴對黃酮轉(zhuǎn)化率的影響。

反應(yīng)時間的影響：以最優(yōu)氯化鋅濃度、pH、總黃酮溶液質(zhì)量濃度、溶劑、反應(yīng)時間進行試驗，考察恒溫振蕩器中振蕩1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h對黃酮轉(zhuǎn)化率的影響。

其中，黃酮轉(zhuǎn)化率的計算公式為：

黃酮轉(zhuǎn)化率(%)=[(C0V0-C1V1)/C0V0]×100

式中:C0為絡(luò)合反應(yīng)前黃酮質(zhì)量濃度;V0為絡(luò)合反應(yīng)前溶液體積;C1為絡(luò)合反應(yīng)后黃酮質(zhì)量濃度;V1為絡(luò)合反應(yīng)后溶液體積。

1.2.3.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇總黃酮溶液質(zhì)量濃度(A)、氯化鋅質(zhì)量濃度(B)、反應(yīng)溫度(C)、pH(D)四個因素進行正交試驗。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.3.3 工藝穩(wěn)定性驗證試驗 稱取適量干燥的刺玫果總黃酮,用無水乙醇溶解,過濾,配制成總黃酮質(zhì)量濃度為8 mg/mL的供試品溶液50 mL,置于具塞錐形瓶中,在50 ℃的水浴中,邊攪拌邊緩慢加入質(zhì)量濃度為14 mg/mL的氯化鋅溶液25 mL,用4% NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為9,恒溫震蕩3.0 h,離心,測定上清液中總黃酮質(zhì)量濃度,收集沉淀得到刺玫果總黃酮Zn2+絡(luò)合物,根據(jù)反應(yīng)前后溶液中黃酮濃度計算黃酮轉(zhuǎn)化率,重復(fù)三次上述試驗。

1.2.4 傅立葉紅外光譜 分別稱取適量干燥的刺玫果總黃酮提取物、總黃酮Zn2+絡(luò)合物,與KBr混合研磨后壓片,測定紅外光譜,掃描范圍:400～4000 cm-1。

1.2.5 體外抗氧化性試驗

1.2.5.1 對羥基自由基(·OH)的清除能力 分別吸取不同質(zhì)量濃度的刺玫果總黃酮溶液及其Zn2+絡(luò)合物溶液、VC溶液各適量,按照參考文獻[13]中的試驗方法,以二甲基亞砜作參比,在536 nm處測其吸光度值A(chǔ)P、As、Ab。供試液對·OH的清除率(η·OH)按公式(1)計算[13],并計算IC50。

η·OH(%)=(AS-AP)/(Ab-AP)×100

式(1)

式中:AP-加入鄰二氮菲、蒸餾水、硫酸亞鐵、0.1% H2O2的吸光度值,As-加入鄰二氮菲、供試液、硫酸亞鐵、0.1% H2O2的吸光度值,Ab-加入鄰二氮菲、蒸餾水、硫酸亞鐵的吸光度值。

式(2)

式中:A1-加入Tris-HCl緩沖液、供試液、鄰苯三酚的吸光度值,A2-加入Tris-HCl緩沖液、供試液、蒸餾水的吸光度值,A3-加入Tris-HCl緩沖液、蒸餾水、鄰苯三酚的吸光度值。

1.2.5.3 抗脂質(zhì)體過氧化作用試驗 分別取不同質(zhì)量濃度的刺玫果總黃酮溶液及其Zn2+絡(luò)合物溶液、VC各適量,按照參考文獻[15]中的試驗方法,在535 nm處測定吸光度Ac、As。供試液對脂質(zhì)體過氧化抑制率按公式(3)計算[15]。并計算IC50。

抑制率(%)=[(Ac-As)/Ac]×100

式(3)

式中:As-加入卵磷脂、硫酸亞鐵、供試液、三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液的吸光度,Ac-加入卵磷脂、硫酸亞鐵、蒸餾水、TCA-TBA-HCl混合液的吸光度。

1.2.5.4 對ABTS自由基陽離子(ABTS+·)的清除能力 將濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合,于23 ℃避光反應(yīng)12～16 h,制備ABTS+·基液。然后用蒸餾水稀釋基液(40～50倍)至其在波長734 nm處吸光度(A空白)為0.705,制得ABTS自由基陽離子工作液。分別吸取不同質(zhì)量濃度的供試品溶液(刺玫果總黃酮溶液及其Zn2+絡(luò)合物),置于10 mL具塞試管中,加入3.9 mL上述工作液混合,于23 ℃避光反應(yīng)6 min,以蒸餾水作空白,于734 nm波長處測其吸光度值A(chǔ)。VC作對照,將VC用蒸餾水配成對照溶液,同法操作。供試品溶液對ABTS+·的清除率(ηABTS+·)按公式(4)計算[16],并計算IC50。

ηABTS+·(%)=(A空白-A)/A空白×100

式(4)

式中:A空白-加入ABTS自由基陽離子工作液,蒸餾水,A-加入ABTS自由基陽離子工作液,供試品溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗至少重復(fù)3次,結(jié)果均以“平均值±標準差”,實驗數(shù)據(jù)使用Origin 8.0進行整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 氯化鋅濃度的影響 由圖1(a)可知,在氯化鋅濃度小于12 mg/mL時,隨著濃度的增加,轉(zhuǎn)化率提高,在12 mg/mL時達到最大,繼續(xù)增加濃度,轉(zhuǎn)化率不再提高。分析其原因可能是因為在12 mg/mL之前,溶液中的黃酮類物質(zhì)未反應(yīng)完全,故隨著金屬離子的加入而繼續(xù)反應(yīng),在12 mg/mL時,幾乎反應(yīng)完全,之后繼續(xù)加入金屬離子轉(zhuǎn)化率不再升高。綜合考慮,加入的氯化鋅濃度為12 mg/mL進行后續(xù)實驗。

2.1.2 pH的影響 由圖1(b)可知,體系pH在8時,轉(zhuǎn)化率最大,小于8時,隨著pH的增加轉(zhuǎn)化率提高,大于8時,轉(zhuǎn)化率反而下降。分析其原因可能是因為隨著溶液堿性的加強,黃酮類物質(zhì)反應(yīng)活性加大,當繼續(xù)加入堿時,部分黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變,導致轉(zhuǎn)化率降低。綜合考慮,選擇pH8、9、10進行后續(xù)實驗。

2.1.3 總黃酮溶液溶度的影響 由圖1(c)可知,在總黃酮濃度為6 mg/mL時,轉(zhuǎn)化率最大,逐漸增加濃度反而使轉(zhuǎn)化率下降。分析其原因可能是因為在6 mg/mL時,黃酮類物質(zhì)與金屬離子反應(yīng)幾乎完全,隨著濃度的繼續(xù)增加,反應(yīng)不再進行,使得轉(zhuǎn)化率下降。綜合考慮,黃酮溶液濃度為6 mg/mL進行后續(xù)實驗。

2.1.4 溶劑的影響 由圖1(d)可知,使用無水乙醇作為溶劑時,轉(zhuǎn)化率最大。分析其原因可能是因為黃酮類物質(zhì)中黃酮苷元含量較多,更容易溶于有機溶液中。綜合考慮,溶劑為無水乙醇進行后續(xù)實驗。

2.1.5 反應(yīng)溫度的影響 由圖1(e)可知,隨著反應(yīng)溫度的升高轉(zhuǎn)化率逐漸提高,在60 ℃達到最大值,繼續(xù)增加溫度反而使轉(zhuǎn)化率下降。分析其原因可能是因為,隨著溫度的提高,分子的擴散速度增快,有利于絡(luò)合物的形成,但是隨著溫度的再提高,部分黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。綜合考慮,選擇反應(yīng)溫度為60 ℃進行后續(xù)實驗。

2.1.6 反應(yīng)時間的影響 由圖1(f)可知,隨著反應(yīng)時間的增加,轉(zhuǎn)化率不斷提高,在達到3.0 h時,轉(zhuǎn)化率達到最大值,繼續(xù)增加時間,轉(zhuǎn)化率降低。分析其原因可能是因為在3.0 h時,反應(yīng)幾乎完全,在此之前,反應(yīng)時間短,未能充分反應(yīng),在此之后,反應(yīng)時間太長,黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變。綜合考慮,選擇反應(yīng)時間為3.0 h。

圖1 不同條件對刺玫果總黃酮Zn2+絡(luò)合物制備的影響Fig.1 Effect of different conditions on the preparation of total flavonoids Zn2+ complexes

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析見表2。由表2可知,總黃酮溶液質(zhì)量濃度(A)、氯化鋅溶液質(zhì)量濃度(B)、反應(yīng)溫度(C)、pH(D)對刺玫果總黃酮金屬絡(luò)合物的制備均有一定的影響,影響大小順序為D>B>A>C,即pH>氯化鋅溶液質(zhì)量濃度>總黃酮溶液質(zhì)量濃度>反應(yīng)溫度,最佳提取條件為A3B3C1D2,即總黃酮溶液質(zhì)量濃度為8 mg/mL,氯化鋅氯化鋅溶液質(zhì)量濃度為14 mg/mL,反應(yīng)溫度為50 ℃,pH為9。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

2.3 工藝穩(wěn)定性驗證試驗結(jié)果

根據(jù)反應(yīng)前后溶液中黃酮濃度計算黃酮轉(zhuǎn)化率分別為96.68%、97.20%、96.94%,平均為96.94%,RSD為0.27%;收集沉淀得到刺玫果總黃酮Zn2+絡(luò)合物,稱其質(zhì)量得收率分別為35.39%、35.39%、36.51%,平均為35.76%,RSD為1.81%。說明該方法穩(wěn)定可行。

2.4 紅外光譜結(jié)構(gòu)表征及分析

如圖2所示,刺玫果總黃酮在3384 cm-1處為-OH特征吸收峰,與Zn2+絡(luò)合后此峰左移至3404 cm-1且由寬峰變窄,說明Zn2+與羥基有配位作用,Zn2+吸電子作用使酚羥基上的H游離[17]。1612 cm-1處為C=O吸收峰,從圖2中可以看出,此處峰的強度明顯降低,說明Zn2+與刺玫果總黃酮中C=O基有配位作用。1074 cm-1處為芳基烷基醚C-O-C的吸收峰,在總黃酮Zn2+絡(luò)合物譜圖中此峰變?nèi)?這是由于與Zn2+配位使苯環(huán)π電子向環(huán)外轉(zhuǎn)移[18]。紅外光譜分析表明,Zn2+與刺玫果總黃酮發(fā)生了絡(luò)合,形成了絡(luò)合物。

圖2 刺玫果總黃酮及其Zn2+絡(luò)合物紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of total flavonoids and Zn2+ complexes

2.5 體外抗氧化性試驗結(jié)果

2.5.1 對羥基自由基(·OH)的清除能力 由圖3可知,刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)和VC(c)對·OH的清除率都隨著其各自質(zhì)量濃度的增加而增加。通過擬合方程可得:刺玫果總黃酮的IC50為1.30 mg/mL,Zn2+絡(luò)合物的IC50為0.78 mg/mL,VC的IC50為1.63 mg/mL。由此可以看出,Zn2+絡(luò)合物對·OH的清除能力最大,其次是刺玫果總黃酮,VC最差。

圖5 刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)和VC(c)的抗脂質(zhì)體過氧化能力Fig.5 Anti-liposome peroxidation capacity of total flavonoids(a),Zn2+ complexes(b)and VC(c)

圖3 刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)和VC(c)對·OH的清除能力Fig.3 Scavenging ability of total flavonoids(a),Zn2+ complexes(b)and VC(c)on ·OH

圖4 刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)和VC(c)對的清除能力Fig.4 Scavenging ability of total flavonoids(a),

圖6 刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)和VC(c)對ABTS+·的清除能力Fig.6 Scavenging ability of total flavonoids(a),Zn2+ complexes(b)and VC(c)on ABTS+·

2.5.3 抗脂質(zhì)體過氧化作用試驗結(jié)果 由圖5可知,刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)、VC(c)對抗脂質(zhì)體過氧化能力都隨著其各自質(zhì)量濃度的增加而增加。通過作擬合方程可得:刺玫果總黃酮的IC50為4.82 mg/mL,Zn2+絡(luò)合物的IC50為1.78 mg/mL,VC的IC50為7.12 mg/mL。由此可以看出,Zn2+絡(luò)合物的抗脂質(zhì)體過氧化能力最強,刺玫果總黃酮次之,而VC能力最差。

2.5.4 對ABTS自由基陽離子(ABTS+·)的清除結(jié)果 由圖6可知,刺玫果總黃酮(a)、Zn2+絡(luò)合物(b)、VC(c)對ABTS自由基陽離子(ABTS+·)的清除能力都隨著其各自質(zhì)量濃度的增加而增加。通過作擬合方程可得:刺玫果總黃酮的IC50為0.06 mg/mL,Zn2+絡(luò)合物的IC50為0.57 mg/mL,VC的IC50為0.08 mg/mL。由此可以看出,刺玫果總黃酮對ABTS+·的清除能力最大,其次是VC,最后是Zn2+絡(luò)合物。

3 結(jié)論