汪璐，趙萍，張欣語(yǔ)，來(lái)小音，李龍宣

缺血性腦卒中具有高病死率、高致殘率的特點(diǎn)。早期靜脈溶栓及血管內(nèi)介入治療可以使部分患者獲益，但臨床上仍有大量腦梗死特別是重型腦梗死患者療效不好。這些腦梗死患者神經(jīng)損傷及修復(fù)的分子機(jī)制尚不完全清楚，臨床上也缺乏便捷有效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）-92a與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、脂質(zhì)代謝及動(dòng)脈硬化的病理生理過(guò)程密切相關(guān)[1,2]。體外敲減miR-92a可顯著抑制腫瘤壞死因子ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNFɑ）誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性黏附分子上調(diào)，并可有效減弱TNF-ɑ對(duì)具有血管保護(hù)作用的內(nèi)皮型一氧化氮合酶的抑制作用[3]。小鼠肢體缺血和心梗后，抑制miR-92a可降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[4]，同時(shí)增加血管新生促進(jìn)損傷修復(fù)[5]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)支循環(huán)不良卒中患者外周血清中miR-92a表達(dá)明顯上調(diào)，其水平與急性腦梗死患者腦側(cè)支循環(huán)的狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)[6]。由于良好的側(cè)支循環(huán)對(duì)急性腦梗死患者具有重要的保護(hù)作用，因而miR-92a可能參與了腦梗死后的神經(jīng)病理?yè)p傷。

我們利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-92a受長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（X inactivate-specific transcript，XIST）靶向作用。LncRNA在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在[7]，它在維持細(xì)胞物質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡和調(diào)節(jié)缺血腦損傷中發(fā)揮重要作用[8-10]。研究還發(fā)現(xiàn)，腦缺血后腦內(nèi)lncRNA表達(dá)出現(xiàn)反應(yīng)性改變[9,11]。那么，miR-92a及l(fā)ncRNA XIST分子在早期腦梗死患者血液中的表達(dá)情況如何?它們能否反映腦梗死患者神經(jīng)功能缺損的程度，它們之間的關(guān)系如何?明確這些問(wèn)題，有助于臨床篩查出腦梗死早期神經(jīng)損傷和修復(fù)的預(yù)測(cè)性生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)針對(duì)性的分子干預(yù)靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月至2019年3月上海市浦東新區(qū)（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬）公利醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者70例納入梗死組，均符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，均在腦梗死急性期入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦出血、復(fù)發(fā)性腦梗死、合并急慢性感染、手術(shù)、創(chuàng)傷、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、結(jié)締組織病、自身免疫病、先天性心臟病、急性心包炎、急性心肌炎、繼發(fā)性高血壓、心力衰竭、心瓣膜病、肺動(dòng)脈栓塞以及服用避孕藥者。我院同期健康體檢者48例納入對(duì)照組。根據(jù)2014年《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》對(duì)患者進(jìn)行診治，患者入院后接受同一腦血管病專業(yè)治療組的治療。本研究獲得公利醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 所有患者入院時(shí)盡快行頭部CT掃描，于發(fā)病24～48 h內(nèi)行MRI（包括MRI平掃與DWI）檢查以明確診斷。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale/Score，NIHSS）對(duì)患者進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分。根據(jù)NIHSS評(píng)分結(jié)果將患者分為輕型梗死組（NIHSS＜7分）43例和重型梗死組（NIHSS≥7分）27例。

1.2.2 標(biāo)本采集 分別在腦梗死患者發(fā)病后48 h、14 d時(shí)，清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血5 mL，室溫下3000 rpm離心10 min，收集血清并放置-80℃保存待測(cè)。

1.2.3 引物序列 miR-92a的引物序列通過(guò)莖環(huán)法設(shè)計(jì)莖環(huán)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物為5’-CTCAACTGGTGTCGT GGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCG-3’，上游引物為5’-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGT CCCG-3’，下游引物為：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；lncRNAXIST上游引物為5’-CTGCTGATCATTTGGT GGTGT-3’，下游引物為5’-CTCTGCCTGACCTGCTA TCAT-3’；外參cel-miR-39-3p逆轉(zhuǎn)錄引物為5’-CTCA ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCA AGCTGA-3’，上游引物為5’-ACACTCCAGCTGGGT CACCGGGTGTAAATC-3’，下游引物為 5’-TGGTGT CGTGGAGTCG-3’。引物干粉離心后稀釋濃度至7.5μmol/L，置于-20℃冰箱備用。

1.2.4 RNA抽提和lncRNAXIST、miR-92a表達(dá)檢測(cè)按文獻(xiàn)報(bào)道[13]，使用Trizol提取液（Servicebio），按試劑操作說(shuō)明抽提各樣本血漿中RNA；應(yīng)用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)qRT-PCR法測(cè)定lncRNA XIST、miR-92a的表達(dá)，外參選擇cel-mir-39-3p。通過(guò)2-△△CT法測(cè)定lncRNA XIST和miR-92a相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)受試者血標(biāo)本至少測(cè)定3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以計(jì)數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，多因素分析采用Logistic回歸分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

梗死組和對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡、當(dāng)前吸煙方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而梗死組高血壓病史、高膽固醇血癥、糖尿病史和心臟病史陽(yáng)性的患者比例明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 血清中l(wèi)ncRNAXIST和miR-92a表達(dá)比較

腦梗死后48 h時(shí)，梗死組患者血清中l(wèi)ncRNA XIST相對(duì)表達(dá)量為（0.57±0.44），低于對(duì)照組的（1.06±1.52）（t=2.550，P=0.012）；梗死組患者血清中miR-92a的水平為（0.62±0.27），高于對(duì)照組的（0.52±0.23）（t=2.137，P=0.035）。

腦梗死后48 h時(shí)，重型梗死組（27例）患者血清中l(wèi)ncRNA XIST相對(duì)表達(dá)量為（0.29±0.25），低于輕型梗死組（43例）的（0.74±0.45）（t=4.814，P＜0.01）；重型梗死組（27例）患者血清中miR-92a的水平為（0.80±0.29），高于輕型梗死組的（0.50±0.18）（t=5.319，P＜0.01）。

梗死組中46例患者分別于發(fā)病后48 h和14 d檢測(cè)血清中l(wèi)ncRNA XIST和miR-92a水平，其中男25例，女21例；年齡56～86歲，平均（69.22±8.00）歲。結(jié)果顯示，發(fā)病后14 d患者血清中l(wèi)ncRNA XIST相對(duì)表達(dá)量為（1.06±0.78），高于發(fā)病后48 h的（0.56±0.44）（t=3.804，P＜0.01）；發(fā)病后14 d患者血清中miR-92a的水平為（0.40±0.15），低于發(fā)病后48 h的（0.61±0.29）（t=4.233，P＜0.01）。

2.3 相關(guān)性分析

將lncRNA XIST和miR-92a表達(dá)量與NIHSS評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，急性腦梗死患者血清中l(wèi)ncRNA XIST水平與NIHSS評(píng)分負(fù)相關(guān)（r=-0.681，P＜0.01）；miR-92a水平與NIHSS評(píng)分正相關(guān)（r=0.415，P＜0.01）；miR92a與lncRNA XIST之間沒(méi)有相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4 多因素Logistic回歸分析

NIHSS＜7分和NIHSS≥7分作為因變量，以lncRNA XIST及miR-92a分別為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，篩選腦梗死后NIHSS評(píng)分的影響因素，在修正年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、高血脂癥以及心臟病等可能的混雜因素后，結(jié)果顯示：lncRNA XIST和miR-92a都是急性腦梗死患者卒中的嚴(yán)重程度的影響因素（均P＜0.01），見(jiàn)表2。

3討論

本研究我們首次探討了急性腦梗死患者血清中l(wèi)ncRNA XIST及miR-92a水平與NIHSS評(píng)分的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腦梗死血清中l(wèi)ncRNA XIST及miR-92a水平在梗死組與對(duì)照組間、神經(jīng)功能缺損程度不同組之間、梗死早期和恢復(fù)期之間均存在差異表達(dá)；且腦梗死患者早期血清中l(wèi)ncRNAXIST水平與NIHSS評(píng)分間存負(fù)性相關(guān)，而miR-92a水平與NIHSS評(píng)分間存在正性相關(guān)，二者均是腦梗死神經(jīng)功能損傷的影響因素。

3.1 腦梗死早期lncRNA XIST下調(diào)及miR-92a上調(diào)與神經(jīng)病理?yè)p傷密切相關(guān)

研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后miR-92a負(fù)向調(diào)節(jié)血管新生并可促進(jìn)炎癥反應(yīng)[3-5]，而抑制或敲減miR-92a可以減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)血管新生，從而利于損傷修復(fù)[4]。近期我們還發(fā)現(xiàn)，腦梗死后側(cè)支循環(huán)不良組抑制血管新生的miR-92a水平比健康對(duì)照組明顯上升；但側(cè)支循環(huán)良好的梗死患者早期血清miR-92a水平則較側(cè)支循環(huán)不良組明顯降低；多因素的logistic回歸分析顯示miR-92a是腦梗死后側(cè)支循環(huán)好壞的獨(dú)立影響因素[6]。由于良好的側(cè)支循環(huán)對(duì)急性腦梗死患者具有重要的保護(hù)作用，因而提示腦梗死后miR-92a升高可能與腦梗死后的神經(jīng)病理?yè)p傷有關(guān)。

表1 2組一般臨床資料比較

表2 lncRNAXIST及miR-92a與急性腦梗死患者NIHSS評(píng)分的logistic分析

如前所述，LncRNA參與調(diào)節(jié)缺血腦損傷[8-10]。且腦缺血后腦內(nèi)lncRNA表達(dá)出現(xiàn)反應(yīng)性改變[9,11]。我們前期利用雙熒光素報(bào)告技術(shù)檢查發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST可與miR-92a直接相互作用，且兩者在小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞上呈相互抑制狀態(tài)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。我們還發(fā)現(xiàn)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血后lncRNA XIST表達(dá)減低（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。那么miR-92a和lncRNA XIST這一對(duì)看似相互拮抗的分子在卒中后的變化如何？它們是否代表著腦梗死后促進(jìn)和對(duì)抗神經(jīng)損傷的兩個(gè)方面？本研究中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，腦梗死早期血清miR-92a分子表達(dá)明顯增高，lncRNA XIST卻顯著降低；較之于輕型卒中，miR-92a在重型卒中患者血中水平更高，但lncRNA XIST表達(dá)更低；相關(guān)性分析顯示，miR-92a水平與NIHSS評(píng)分正相關(guān)，lncRNA XIST水平與NIHSS評(píng)分負(fù)相關(guān)；Logistic回歸分析顯示，miR-92a和lncRNA XIST均是急性腦梗死患者神經(jīng)缺損程度的影響因素，這些結(jié)果提示miR-92a和lncRNA XIST分子參與了腦梗死后神經(jīng)病理?yè)p傷的過(guò)程。

3.2 腦梗死恢復(fù)期lncRNA XIST及miR-92a水平趨于改善反映出神經(jīng)損傷后的自我修復(fù)

臨床前期研究證實(shí)，卒中后在缺血的腦內(nèi)不僅有被動(dòng)的死亡，也存在積極的修復(fù)，特別是在半暗帶區(qū)內(nèi)機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制觸動(dòng)神經(jīng)和血管之間相互作用從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[14]。本研究結(jié)果顯示，與卒中后早期（48 h）相比，急性腦梗死患者血清中miR-92a水平在卒中后恢復(fù)期（14 d）時(shí)水平顯著降低，而lncRNA XIST相對(duì)表達(dá)量卻明顯增高?？紤]到miR-92a及l(fā)ncRNA XIST代表著卒中后神經(jīng)損傷和修復(fù)的兩個(gè)方面，因此，恢復(fù)期lncRNA XIST及miR-92a水平趨于改善則反映出梗死后神經(jīng)損傷后的自我修復(fù)和功能重建。

3.3 靶向作用于miR-92a和lncRNA XIST分子具有潛在臨床治療價(jià)值

由于miR-92a受lncRNA XIST靶向作用，我們推測(cè)miR-92a表達(dá)水平可能會(huì)隨著lncRNA XIST變化而改變，但相關(guān)性分析顯示腦梗死后血清中二者之間并不是直接簡(jiǎn)單的線性相關(guān)，這提示，腦梗死后多種分子發(fā)生交互作用是個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)著腦梗死的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后，除了miR92a與lncRNA XIST之間能相互作用外，二者本身也還可能還受其他分子的調(diào)節(jié)和影響。lncRNA的一個(gè)主要功能即是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA功能而間接解除miRNA對(duì)功能蛋白的抑制作用[9]，鑒于miR92a與lncRNA XIST分別具有促卒中后神經(jīng)損傷和修復(fù)的潛在作用，上調(diào)lncRNA XIST表達(dá)或抑制miR-92a功能可能有利于腦梗死后神經(jīng)功能的修復(fù)，但這尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的佐證。

本研究尚存在不足：首先，所選擇的病例均是我院急性缺血性卒中患者，沒(méi)有多中心的對(duì)比研究；其次樣本量不足夠大，這些都可能引起實(shí)驗(yàn)偏倚。因此，在后期我們將進(jìn)一步聯(lián)合多家醫(yī)院、擴(kuò)大樣本數(shù)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論。