陳 敏，李高生，冼建鴻，王 煒，閻 晶，董倩雯，盧其明*

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510642；2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642）

尿素是目前世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛、使用量最大的肥料品種，是土壤肥力的主要來源之一［1］。尿素施入土壤后，只有少量以分子態(tài)的形式被土壤膠體吸附，而絕大部分被土壤中的脲酶催化迅速水解為碳酸銨，容易造成氨揮發(fā)、硝化-反硝化等途徑的損失，導(dǎo)致尿素的利用率低［2］。脲酶是土壤微生物體內(nèi)與氨轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的一種水解酶，廣泛存在于植物、細(xì)菌、真菌、藻類和無脊椎動(dòng)物中，脲酶活性強(qiáng)弱直接影響土壤氨揮發(fā)損失［3-4］。在尿素中添加脲酶抑制劑能夠抑制土壤脲酶的活性，抑制脲酶對尿素的水解作用，減緩尿素向銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化，抑制氨的揮發(fā)，從而提高尿素的利用率，對提高作物產(chǎn)量、保護(hù)環(huán)境等方面起到了積極作用［5-7］。

現(xiàn)今國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的脲酶抑制劑主要有重金屬鹽類、酚醌類、磷胺類和雜環(huán)類等，但在眾多種類的脲酶抑制劑當(dāng)中，很難找到廉價(jià)、低毒、無污染的脲酶抑制劑。N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）是目前使用較廣泛且增長速度最快的脲酶抑制劑［8］，但其價(jià)格較高，且人們對其安全性仍存疑慮。所以，研制新型的高效脲酶抑制劑將會(huì)是今后的重要研究方向之一［9］。

我國是產(chǎn)棉大國，絕大部分棉花品種的棉仁、棉根皮中棉酚含量很高，目前除少量作為避孕藥物外，絕大部分作為有害物質(zhì)去除，未得到有效利用。有研究顯示，棉酚及其衍生物對土壤脲酶活性具有一定的抑制作用，為廢棄棉酚的利用提供了有效途徑［10-12］。近年棉籽加工使用溶劑萃取法逐步增多，主要工藝是先將棉仁用溶劑汽油萃取出棉籽油，再用甲醇萃取出棉酚。甲醇萃取液中富含棉酚和被甲醇溶解的有機(jī)物，在蒸發(fā)回收甲醇的過程中產(chǎn)生大量棉酚渣。棉酚渣中除含有棉酚及其二聚、三聚產(chǎn)物和各種衍生物外，還含糖類、游離脂肪酸等，成份復(fù)雜。除了棉酚，棉酚渣中的其他各種有機(jī)物對尿素水解及氨揮發(fā)也會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響［13］。本文以棉酚渣為添加劑，通過實(shí)驗(yàn)室模擬探究棉酚渣對尿素水解及氨揮發(fā)的影響，為利用棉籽加工廢棄物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自廣州五山華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園內(nèi)，為紅壤，基本理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)含量為19.1～37.5 g/kg，全氮含量為0.87～1.58 g/kg，全磷含量為0.61～0.64 g/kg，pH值為5.0～5.5。土壤采集后鋪平風(fēng)干，過0.15 mm篩，裝袋備用。

供試棉酚渣為中棉紫光棉籽加工工藝的殘?jiān)合扔眉和闉橹饕煞莸娜軇┙雒拮延?，再?5%甲醇水溶液提取棉酚，通過薄膜蒸發(fā)甲醇提取液后的殘余物即為棉酚渣。

1.2 主要儀器和試劑

TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)，QYC型全溫控空氣搖床，7200型可見分光光度計(jì)，所用試劑均為市售分析純試劑。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試劑的配制

測試尿素殘留差異率（二乙酰一肟法）［14］：（1）二乙酰一肟（DAM）溶液：稱取2.50 g二乙酰一肟溶于50 mL燒杯中，攪拌直到完全溶解，定容100 mL；（2）氨基硫脲（TSC）溶液：稱取0.25 g氨基硫脲溶于50 mL燒杯中，攪拌直到完全溶解，定容100 mL；（3）混酸溶液：在500 mL燒杯中加入100 mL水，緩慢加入85%磷酸300 mL和98%濃硫酸10 mL，在冰水浴中緩慢攪拌，定容500 mL；（4）顯色劑：量取25 mL二乙酰一肟溶液和10.0 mL氨基硫脲溶液，加入至500 mL混酸溶液中，搖晃使其均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；（5）緩沖液：稱取22.25 g磷酸氫二鈉和17.00 g磷酸二氫鉀于裝有800 mL水的燒杯中，定容至2 L，搖晃均勻；（6）10%尿素溶液：尿素與水按質(zhì)量比1∶9混合均勻，稱取50℃烘箱干燥后的尿素50.0 g溶于450 mL水中，裝于500 mL試劑瓶中備用。

測試氨揮發(fā)量［15］：（1）2%硼酸溶液：稱取6.00 g硼酸置于1 000 mL燒杯中，加入294 mL蒸餾水溶解備用；（2）1%甲基紅溶液：稱取0.50 g甲基紅溶于50 mL無水乙醇中，裝于棕色瓶內(nèi)備用；（3）1%溴甲酚綠溶液：稱取0.50 g溴甲酚綠溶于50 mL無水乙醇中，裝于棕色瓶內(nèi)備用；（4）混合指示劑：溴甲酚綠-甲基紅，體積比3∶2。

1.3.2 尿素水解抑制試驗(yàn)

將一定量棉酚渣與10.0 g風(fēng)干土放入250 mL錐形瓶中，混合均勻，加入50 mL緩沖液和10.0 mL 10%尿素溶液，搖勻。放入設(shè)定好溫度的全溫控空氣搖床中培養(yǎng)。一段時(shí)間后取出錐形瓶，對溶液進(jìn)行離心。將離心后的溶液定容至250 mL。用移液槍取1.00 mL溶液到50 mL容量瓶內(nèi)，加30 mL顯色劑，輕搖容量瓶2 s后放入沸水浴中加熱30 min，然后立即在流動(dòng)的自來水中降溫15 min，再用水定容至50 mL。用分光光度計(jì)在520 nm波長處測定吸光度，進(jìn)行尿素殘留量檢測，計(jì)算尿素殘留差異率。

式中：R為添加棉酚渣的土壤尿素剩余量，R0為未添加棉酚渣的土壤尿素剩余量。

1.3.3 土壤氨揮發(fā)抑制試驗(yàn)

將40.0 g過篩后的土壤與一定量的棉酚渣混勻，放入1 L廣口瓶中，加入4.00 g尿素固體，搖勻；將裝有20 mL含2%硼酸溶液及酸堿指示劑（2～3滴）吸收液的無蓋稱量瓶放入廣口瓶中，密封廣口瓶，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出，用硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點(diǎn)，記錄所需硫酸體積。在不考慮氣體擴(kuò)散速率和溶液吸收速率不同的情況下，可認(rèn)為氨氣的釋放量與滴定所需的硫酸體積成正比，檢測氨氣的吸收量，計(jì)算氨揮發(fā)抑制率。所用裝置如圖1所示。

式中：n0為未加棉酚渣的土壤氨氣釋放量，n為添加棉酚渣的土壤氨氣釋放量。

圖1 氨氣吸收裝置示意圖

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.6軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉酚渣施用量對尿素水解和氨揮發(fā)量的影響

2.1.1 棉酚渣施用量對尿素水解的影響

35℃條件下，設(shè)定棉酚渣用量分別為0、6、8、10、12 g，其中用量0 g為對照，比較不同棉酚渣用量對土壤脲酶活性的抑制效果。緩沖液加入量為50 mL，10%尿素用量為10 mL；每組分成5批次分別于2、4、6、8、12 d取出，測定尿素剩余量，結(jié)果見圖2。

圖2 棉酚渣施用量對尿素水解的影響

從圖2中曲線可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，試驗(yàn)組和對照組的尿素剩余量均逐漸減少，不同棉酚渣用量在4～8 d時(shí)段內(nèi)尿素剩余量差異明顯。在2和12 d時(shí)，由于尿素殘留量太多或太少而差異不明顯。如果用尿素殘留差異率分析，在第4 d時(shí)試驗(yàn)組的尿素殘留差異率都達(dá)到了試驗(yàn)期間的最大值，6～12 g棉酚渣用量的試驗(yàn)組的尿素殘留差異率在67.02%～78.81%。整體上來看，棉酚渣的加入對尿素水解有明顯的抑制作用，且在培養(yǎng)4～8 d期間能夠有效抑制尿素水解。

2.1.2 棉酚渣施用量對土壤氨揮發(fā)的影響

在溫度35℃，風(fēng)干土40.0 g，加水量為10 mL的條件下，比較不同棉酚渣用量（0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 g）對土壤氨揮發(fā)的影響。由圖3可知，隨著棉酚渣施用量的增加，氨氣檢測量逐漸減少，表明氨揮發(fā)量減少。由圖4可知，氨揮發(fā)抑制率逐漸升高，在棉酚渣用量為2.0 g時(shí)，氨揮發(fā)抑制率達(dá)到80.40%。棉酚渣能有效降低土壤氨揮發(fā)量，并且抑制效果隨著棉酚渣施用量的增加而增強(qiáng)。除了棉酚渣抑制尿素水解的原因外，可能加入棉酚渣對NH4+具有吸附作用或?qū)λ夂蟮耐寥廊芤簆H變化具有緩沖作用。

2.2 土壤含水量變化對棉酚渣抑制尿素水解及土壤氨揮發(fā)的影響

2.2.1 加水量對棉酚渣抑制尿素水解的影響

分別加0、5、10、30、50 mL緩沖液于10.0 g風(fēng)干土中，各自再加入10.0 g棉酚渣，10%尿素溶液10 mL，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)2 d后取出測定剩余尿素量，以不加棉酚渣的處理為對照組，結(jié)果如圖5。

圖3 棉酚渣施用量對氨氣揮發(fā)量的影響

圖4 棉酚渣施用量對氨揮發(fā)的抑制率的影響

圖5 緩沖液加入量對尿素水解的影響

由圖5可知，在全部緩沖液加入量范圍內(nèi)，水土比依次為1.0、1.5、2.0、4.0、6.0（包括尿素溶液加入的水分），棉酚渣對尿素水解均顯示有較強(qiáng)的抑制作用，差異較小。但隨著緩沖液加入量的增加，無論有無棉酚渣，尿素殘余量均出現(xiàn)先降后升的趨勢，即尿素的水解量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢?？赡芗尤胍欢康木彌_液，嚴(yán)格控制土壤pH值，有利于脲酶發(fā)揮作用。但隨著緩沖液用量的繼續(xù)增加（水土比為2.0以上），由于水對尿素和脲酶的稀釋作用，尿素的剩余量逐漸增加。

2.2.2 加水量對棉酚渣抑制土壤氨揮發(fā)的影響

分別加水0、5、10、15、20、25、30 mL于40.0 g風(fēng)干土壤中，土壤含水率分別為3.5%、14.2%、22.8%、29.8%、35.0%、40.6%、44.9%（濕基），在棉酚渣用量0.40 g的條件下，考察不同加水量對棉酚渣抑制土壤氨揮發(fā)的影響。

從圖6可以看出，隨加水量的增大，氨氣檢測量先增加后減少，在加水量10 mL（土壤含水量22.8%）時(shí)，氨氣檢測量最大。加水量增大可能增強(qiáng)脲酶活性和產(chǎn)酶微生物的活性，但繼續(xù)增加土壤含水量會(huì)導(dǎo)致水解產(chǎn)生的NH4+（或 NH3）溶解在土壤溶液中而減少揮發(fā)。棉酚渣的抑制作用顯示在圖7中，加水量少時(shí)可能由于脲酶活性低或棉酚渣分散較差的原因，并無明顯的抑制作用，隨著加水量的增加（土壤含水量22.8%以上），棉酚渣對氨揮發(fā)的抑制率增大，達(dá)到45%以上。

圖6 加水量對氨氣揮發(fā)量的影響

圖7 加水量對氨揮發(fā)抑制率的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對棉酚渣抑制尿素水解及土壤氨揮發(fā)的影響

2.3.1 培養(yǎng)溫度對棉酚渣抑制尿素水解的影響

在10.0 g棉酚渣的使用量保持不變的情況下，探究不同培養(yǎng)溫度對棉酚渣抑制尿素水解的影響。設(shè)置20、25、30、35、40℃5個(gè)處理，每個(gè)處理均設(shè)置不添加棉酚渣的對照。向錐形瓶中依次加入10.0 g風(fēng)干土，50 mL緩沖液，10%尿素溶液10 mL（水土比6.0），培養(yǎng)2 d后，取出樣品測定尿素剩余含量，計(jì)算尿素殘留差異率，如圖8所示。

圖8 培養(yǎng)溫度對尿素殘留差異率的影響

隨著培養(yǎng)溫度的升高，尿素殘留差異率逐漸增加，培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，尿素殘留差異率達(dá)到最大，達(dá)到了79.72%；當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高至40℃后，尿素殘留差異率仍有76.62%。培養(yǎng)溫度降低時(shí)尿素殘留迅速下降，在20℃時(shí)只有23.83%。因此，棉酚渣的加入能夠有效減緩尿素的水解，在高溫段尿素水解加快，棉酚渣的作用突顯。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對棉酚渣抑制土壤氨揮發(fā)的影響

在棉酚渣用量0.40 g，加水量為10 mL的條件下，考察不同培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40℃）對棉酚渣抑制土壤氨揮發(fā)的影響，結(jié)果如圖9、圖10所示。

由圖9可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，氨氣的釋放量逐漸增加，表明氨氣的揮發(fā)量受溫度的影響較大，溫度升高促進(jìn)氨的揮發(fā)。由圖10可知，棉酚渣對土壤氨揮發(fā)的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在30℃時(shí)棉酚渣對土壤氨揮發(fā)的抑制率最大，達(dá)到55.34%，而其它溫度時(shí)的氨揮發(fā)的抑制率在36.67%～44.97%。從抑制率的角度看，在適宜的溫度下效果明顯，可能是在產(chǎn)酶菌活性高的條件下，棉酚渣對土壤氨揮發(fā)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

圖9 培養(yǎng)溫度對氨氣揮發(fā)量的影響

圖10 培養(yǎng)溫度對氨揮發(fā)抑制率的影響

3 結(jié)論與討論

棉酚渣中除了棉酚及其聚合物、衍生物外，還有糖類、游離脂肪酸等有機(jī)物，棉酚及其部分衍生物對土壤脲酶有較強(qiáng)的抑制作用［12］，其他有機(jī)物也可能有類似腐植酸的抑制作用［13］。另一方面，有機(jī)物有可能成為產(chǎn)酶微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于微生物的繁殖。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，棉酚渣的存在對尿素水解及土壤氨揮發(fā)顯示較強(qiáng)的抑制作用，可視為抑制作用占主導(dǎo)。

土壤的含水量的變化，對棉酚渣抑制尿素水解作用的影響不明顯，但對棉酚渣抑制氨揮發(fā)的影響大。隨著土壤含水量的增加，棉酚渣對土壤氨揮發(fā)的抑制率逐漸增大。在土壤含水率22.8%以上時(shí)，棉酚渣對氨揮發(fā)的抑制劑達(dá)45%以上。由于溶解的原因，土壤含水率大時(shí)氨揮發(fā)量較小，對棉酚渣的抑制效果有所掩蓋。

溫度的變化對脲酶活性的影響較大，對土壤產(chǎn)酶菌的影響也很大，從而影響了棉酚渣的使用效果。在適宜的溫度下棉酚渣對尿素水解的抑制效果比較明顯，但高溫下氨易揮發(fā)，掩蓋了棉酚渣的抑制效果。棉酚渣的脲酶抑制作用可能和大多脲酶抑制劑一樣屬于混合性抑制［11，16］，抑制機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

整體來看，棉酚渣對尿素水解及土壤氨揮發(fā)具有一定抑制作用，但還需要進(jìn)一步通過盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)對其抑制效果進(jìn)行綜合評價(jià)。