林書震，李小龍，李紅麗，詹義忠，蘆阿虔，田艷華，王 巖

（1．鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450000；2．南平市煙草公司邵武分公司，福建 邵武 354000）

微生物是土壤的重要組成部分，也是土壤中最活躍的部分［1］。微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性對維持土壤系統(tǒng)的健康起著極其重要的作用［2-4］，某些土傳病害的發(fā)生在一定程度上是土壤微生物群體相互作用的結(jié)果［5-6］。煙草青枯病是由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的細(xì)菌性土傳病害，在我國南方煙區(qū)大面積發(fā)生，造成大規(guī)模減產(chǎn)［7］。青枯病的防控以往都主要集中在抗性育種選育、物理防控、化學(xué)試劑防控及改善栽培管理等方面。雖然各類研究成果對青枯病的防控均取得了一定效果，但目前煙草青枯病仍是生產(chǎn)上的一大難題［8-10］。一些關(guān)于煙草青枯病防控的研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物數(shù)量和種類會隨煙株的生長發(fā)生變化［11-13］，但基于稀釋平板法等傳統(tǒng)手段研究土壤中微生物的數(shù)量和種類，很難從整體上明晰土壤微生物的變化特征［14］，也難以發(fā)現(xiàn)具體是哪些微生物與煙草青枯病有關(guān)。近年來，分子生物技術(shù)快速發(fā)展和應(yīng)用為研究微生物群落結(jié)構(gòu)特征提供了廣闊的空間［15］。第二代高通量測序技術(shù)能夠?qū)?shí)驗(yàn)室不可培養(yǎng)的微生物通過16S/18S rDNA基因測序的方法檢測出來，對分析微生物群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，成為研究土壤微生物的重要工具［16-17］。

邵武市是福建省煙葉種植面積最大的一個煙區(qū)，位于武夷山南麓，生產(chǎn)中煙草青枯病發(fā)生較為嚴(yán)重。本試驗(yàn)在邵武市煙區(qū)選取代表性煙田，對煙株生長過程中土壤微生物進(jìn)行16S/18S rDNA基因測序，分析土壤微生物特性、功能及其多樣性變化等，探討煙株生長過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其改變與青枯病發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系，為定向調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤健康質(zhì)量的措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年2～7月在福建省邵武市（N26°55′～ 27°35′，E117°2′～ 117°52′）城郊芹田村、沿山百樵村、沿山上訪組、大竹洋坑村4個植煙區(qū)進(jìn)行。氣候條件屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫暖濕潤，日照充足，雨量充沛，常年平均降水量1 800 mm左右，年平均氣溫18℃，試驗(yàn)地點(diǎn)海拔200～250 m。

1.2 試驗(yàn)材料

供試煙田在移栽前以條溝方式施用煙草專用肥，然后在團(tuán)棵期和旺長期再進(jìn)行追肥。移栽時施煙葉專用肥25 kg（666.7 m2用量，下同），牛糞有機(jī)肥100 kg，鈣鎂磷肥30 kg，團(tuán)棵期追施硝酸鉀25 kg，旺長期硫酸鉀18 kg。煙田土壤類型為沙土、壤質(zhì)，含水量均在20%～25%之間，其他土壤理化性質(zhì)見表1。供試烤煙品種為K326。試驗(yàn)地前茬作物均為水稻。

表1 煙田土壤理化性質(zhì)

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取地理位置間隔較遠(yuǎn)、地勢平坦、農(nóng)業(yè)管理措施相同的4個植煙區(qū)，每個煙區(qū)分別選取土壤類型相同的健康（青枯病發(fā)病率低，20%以下）和非健康（青枯病發(fā)病率高，20%以上）兩塊田作為試驗(yàn)田。樣本編號Y、T、W、C分別表示煙株移栽前、團(tuán)棵期、旺長期、采摘期，編號最后的數(shù)字1和2分別表示健康煙田和非健康煙田。分別在煙株移栽前、團(tuán)棵期、旺長期和采摘期采取根部土壤進(jìn)行可培養(yǎng)微生物數(shù)量測定和16S/18S rDNA基因測序，并進(jìn)行其他理化性狀分析。

1.4 測定內(nèi)容及方法

1.4.1 土樣采集

分別在煙株移栽前、團(tuán)棵期（移栽后40 d）、旺長期（移栽后70 d）和采摘期（移栽后100 d），采用S型五點(diǎn)取樣法采取煙株根部土壤。取樣時首先去除煙株根部表層土壤，以煙株莖部為中心直徑10 cm左右、深10 cm左右處的土壤進(jìn)行取樣。取樣后用密封袋低溫封存，部分送往實(shí)驗(yàn)室在4℃下冷藏以待微生物數(shù)量測定，部分用15 mL離心管裝滿立即送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對微生物進(jìn)行基因測序。

1.4.2 微生物數(shù)量測定

采用稀釋平板法［18］測土壤微生物數(shù)量。準(zhǔn)確稱取10 g鮮土，加到盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上以150 r/min震蕩30 min，使其充分混勻，靜止后吸取5 mL上清液于45 mL無菌水中充分混合均勻得到10-1梯度的溶液，依次稀釋至10-1～10-5濃度的土壤溶液待用。吸取200 μ L不同稀釋度的土壤溶液涂布在平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每個樣本選擇3個濃度梯度的土壤溶液，每個濃度梯度涂3板，取平板菌落數(shù)的平均值計(jì)算該樣本土壤中微生物的數(shù)量。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基，真菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.4.3 微生物基因測序

土壤微生物基因測序采用第二代高通量測序技術(shù)，對煙株不同生長時期的土壤樣本進(jìn)行細(xì)菌（16S rDNA）和真菌（18S rDNA）序列檢測。測序原理與步驟如下：

DNA抽提和PCR擴(kuò)增：根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠泳檢測DNA提取質(zhì)量；細(xì)菌16S用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；真菌18S用SSU081F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和 1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物對V5-V7可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

Illumina Miseq測序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫，16S為PE 2*300文庫，18S為PE2*250文庫。用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中。

數(shù)據(jù)處理：原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，使用UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010對微生物數(shù)量進(jìn)行計(jì)算分析和統(tǒng)計(jì)，測序數(shù)據(jù)在上海某公司提供的I-Sanger生物信息分析云平臺進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)微生物數(shù)量

室內(nèi)微生物培養(yǎng)結(jié)果表明，不同植煙區(qū)在煙株生長發(fā)育的各個時期土壤微生物的變化特征較為相似（表2），微生物數(shù)量為細(xì)菌＞放線菌＞真菌，依次相差一個數(shù)量級。煙田土壤整體微生物數(shù)量水平偏低，細(xì)菌數(shù)量級僅有106～107，這可能是酸性土壤不利于細(xì)菌生長，這與前人的研究一致［11-13］。細(xì)菌數(shù)量隨著煙株生長發(fā)育的進(jìn)程呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，在旺長期數(shù)量達(dá)到最大，較上一生長時期增加2～5倍；放線菌的數(shù)量變化規(guī)律與細(xì)菌相似，不同的是放線菌數(shù)量在團(tuán)棵期下降，隨后在旺長期達(dá)到最大；真菌數(shù)量隨著煙株生長先減少后增多，在旺長期又降至最低。

表2 煙田土壤微生物數(shù)量

2.2 測序結(jié)果分析

2.2.1 測序結(jié)果概述

對各試驗(yàn)田土壤樣本中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到細(xì)菌優(yōu)化序列數(shù)目1 170 563條，真菌1 170 627條。為了研究樣品的物種組成多樣性，對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%相似水平將序列聚類成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）。測序結(jié)果顯示，所有土壤樣品中細(xì)菌共有49個門，119個綱，246個目，456個科，891個屬，1 856個種，6 136個OTU；真菌共有47個門，83個綱，115個目，137個科，171個屬，257個種，614個OTU。

2.2.2 細(xì)菌群落組成

如果將豐度＞10%的細(xì)菌劃分為優(yōu)勢類群［19］，煙株移栽前土壤中細(xì)菌在門水平上的優(yōu)勢類群為Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）和Actinobacteria（放線菌門），豐度分別為33.45%±6.58%、18.40%±4.82%、14.79%±4.39%和10.27%±2.44%，占細(xì)菌總量的76.91%±1.39%；團(tuán)棵期優(yōu)勢類群為Proteobacteria（34.50%±2.97%）、Acidobacteria（18.19%±2.23%）和Chloroflexi（14.45%±1.22%），占細(xì)菌總量的67.14%±1.46%，其中Actinobacteria豐度在團(tuán)棵期減少到8.59%±1.13%；旺長期優(yōu)勢類群為Proteobacteria（32.16%±4.57%）、Actinobacteria（18.38%±1.72%）、Chloroflexi（16.14%±3.22%）和Acidobacteria（12.74%±2.70%），占細(xì)菌總量的79.43%±2.39%，其中Actinobacteria豐度增長明顯，僅次于Proteobacteria；采摘期優(yōu)勢類群為Proteobacteria（30.32%±5.03%）、Actinobacteria（17.92%±2.34%）、Chloroflexi（17.03%±4.00%）和Acidobacteria（12.18%±1.92%），占細(xì)菌總量的77.45%±2.07%。

不同植煙區(qū)各個時期細(xì)菌優(yōu)勢類群Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi和Actinobacteria的豐度總和一直穩(wěn)定在77%左右，如圖1所示。煙株移栽前和團(tuán)棵期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，旺長期和采摘期的群落結(jié)構(gòu)較為相似，但旺長期則發(fā)生了明顯地改變。其中，優(yōu)勢類群中變化最為顯著的是Actinobacteria和Acidobacteria。不同植煙區(qū)Actinobacteria豐度較團(tuán)棵期增加了85%～136%，但Acidobacteria豐度減少了15%～56%。豐度低于10%的類群中Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）和Planctomycetes（浮霉菌門）等在煙株生長過程中也發(fā)生了較大變化，其中，F(xiàn)irmicutes和Planctomycetes豐度在旺長期較前一時期分別增加了92%～402%和34%～235%，而Bacteroidetes和Gemmatimonadetes豐度分別減少了12%～77%和36%～56%。健康和非健康之間煙田土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異。

圖1 煙田土壤中細(xì)菌在門水平上的群落組成

選取相對豐度前20位的屬水平上的細(xì)菌，根據(jù)其在每個樣品中的相對豐度信息繪制成熱圖（圖2）。在煙株的整個生長時期，變化較明顯的細(xì)菌有Nitrospira（硝化螺旋菌屬）、Rhodanobacter（產(chǎn)黃桿菌屬）、unclassified_f__Micrococcaceae（微球菌科下的屬）、norank_p__Saccharibacteria（未分類門下的屬）、norank_o__Subgroup_7（酸桿菌綱下的屬）、norank_f__Nitrosomonadaceae（亞硝化單胞菌科下的屬）、norank_c__JG37-AG-4（綠彎菌門下的屬）和Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）。這些細(xì)菌均在旺長期前后發(fā)生了變化，如Rhodanobacter的相對豐度在團(tuán)棵期較多，隨后在旺長期減少；unclassified_f__Micrococcaceae的相對豐度在團(tuán)棵期較少，隨后增多。

圖2 煙田土壤中細(xì)菌在屬水平上的熱圖

2.2.3 真菌群落組成

各植煙區(qū)不同生長時期的真菌優(yōu)勢類群（＞5%）的豐度和一直穩(wěn)定在90%左右，但其種類和豐度變化明顯。由圖3可以看出，煙株移栽前真菌在門水平上的優(yōu)勢類群為Ascomycota（子囊菌門）、norank-k-Fungi、Basidiomycota（擔(dān)子菌門），豐度分別為66.05%±12.33%、13.51%±6.54%和11.27%±6.27%，占真菌總量的90.85%±3.07%；團(tuán)棵期優(yōu)勢類群為Ascomycota（59.73%±12.86%）、norank-k-Fungi（22.95%±12.06%）和Basidiomycota（6.26%±2.91%）， 占 真 菌 總 量 的88.23%±2.42%； 旺長期優(yōu)勢類群只有Ascomycota，豐度到達(dá)了89.71%±4.56%，norank-k-Fungi和Basidiomycota豐度分別降到了2.87%±2.67%和4.55%±2.44%，其中norank-k-Fungi豐度減少最明顯；采摘期優(yōu)勢類群為Ascomycota（80.94%±7.77%）、Basidiomycota（6.97%±3.36%），占真菌總量的87.91%±5.65%。Ascomycota在煙田土壤中的豐度最高，旺長期豐度最高，各植煙區(qū)較團(tuán)棵期分別增長了17%～108%，且Ascomycota在非健康煙田土壤中的豐度一直大于健康煙田；norank-k-Fungi豐度在團(tuán)棵期煙田土壤中最多，旺長期后豐度驟減，不同植煙區(qū)分別減少了51%～97%，且norank-k-Fungi在非健康煙田土壤中的豐度一直小于健康煙田；Basidiomycota豐度隨煙株生長先減少后增多，移栽前豐度最高，旺長期豐度最低。在＜5%的類群中，Chytridiomycota（壺菌門）的變化同樣很顯著，移栽前和團(tuán)棵期豐度為2.23%±1.10%，旺長期和采摘期豐度為0.52%±0.37%，平均減少了75%。由此發(fā)現(xiàn)煙田土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)在煙株生長發(fā)育過程中差別較大，其中旺長期變化最為明顯。

如圖4所示，相對豐度前20位的屬水平上的真菌隨煙株生長的變化較小。norank_k__Fungi（未分類門下的屬）的相對豐度在團(tuán)棵期后明顯減少；Pseudallescheria（假霉樣真菌屬）、unclassified_o__Pezizales（盤菌目下的屬）屬于子囊菌門，在采摘期明顯增多。這與門水平上的分析一致。

圖3 煙田土壤中真菌在門水平上的群落組成

圖4 煙田土壤中真菌在屬水平上的熱圖

2.3 煙田土壤微生物多樣性

2.3.1 微生物Alpha多樣性

環(huán)境中微生物的多樣性（Alpha）分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性變化（表3）。Coverage指數(shù)是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。本實(shí)驗(yàn)中各樣本細(xì)菌的Coverage值都在94%以上，真菌的Coverage值都在99%以上，表明本次測序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況。Sobs（the observed richness）值表示豐富度實(shí)際觀測值，既OTU數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌Sobs指數(shù)在各生長時期差異不大，非健康煙田土壤中Sobs有先增長后減少的趨勢；真菌Sobs指數(shù)在旺長期最少。Chao指數(shù)反映群落豐富度（Community richness），指數(shù)越大群落豐富度越高；Shannon指數(shù)能反映群落多樣性（Community diversity），Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。非健康煙田土壤中細(xì)菌的Chao、Shannon指數(shù)均值在煙株團(tuán)棵期時達(dá)到最高，隨后逐漸降低，表明細(xì)菌群落在煙株團(tuán)棵期時最為豐富、多樣性最高，而健康土壤中細(xì)菌的多樣性指數(shù)沒有明顯規(guī)律；真菌的Chao、Shannon指數(shù)均在煙株的旺長期時最低，與稀釋平板法中真菌的數(shù)量相吻合，表明真菌群落在煙株旺長期時豐富度降低、多樣性減少。健康和非健康煙田之間土壤微生物的Alpha多樣性沒有顯著性差異。

表3 煙田土壤中微生物的Alpha多樣性

2.3.2 微生物樣本層級聚類分析

研究不同樣本的相似性和差異關(guān)系，可對樣本距離矩陣進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樣本層級聚類樹。圖5是分別將煙田土壤樣本中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行層級聚類分析。從a圖中發(fā)現(xiàn)除了移栽前的Y1-2樣本，移栽前和團(tuán)棵期樣本聚在同一樹枝上，旺長期和采摘期樣本聚在同一樹枝上。從a圖中還可以發(fā)現(xiàn)，移栽前和旺長期所有屬于健康煙田的樣本距離較近，健康與非健康煙田土壤樣本明顯分開。旺長期和采摘期也是相似的規(guī)律。這說明不僅煙株生長改變了土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，而且青枯病發(fā)生也可能影響了土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，即導(dǎo)致健康與非健康煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間出現(xiàn)了較大差異。對煙田土壤樣本的真菌進(jìn)行層級聚類分析發(fā)現(xiàn)，前兩個時期樣本聚在一起，后兩個時期樣本聚在一起，而健康和非健康土壤樣本之間沒有明顯的聚類，表明只有煙株生長對真菌的群落組成的影響程度較大。

圖5 煙田土壤微生物在OTU水平上的層級聚類分析

2.3.3 微生物物種差異分析

根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，可以檢測不同組（樣本）微生物群落中豐富度差異的物種，并通過假設(shè)性檢驗(yàn)評估觀察其差異的顯著性。比較本實(shí)驗(yàn)所有植煙區(qū)的4個時期結(jié)果（圖6和圖7）發(fā)現(xiàn)，門水平上細(xì)菌優(yōu)勢菌群Acidobacteria和Actinobacteria的P值分別為0.000 509 5和 1.13×10-10， 遠(yuǎn) 小 于 0.001， 表 明這兩種菌群在不同時期豐度變化顯著。除此之外，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes等菌群的P值也小于0.001。真菌優(yōu)勢類群中Ascomycota和norank-k-Fungi的P值分別為0.000 039 95和0.000 560 1，表明這兩種菌群在整個煙株生長過程中變化顯著。煙田土壤中多種微生物豐度都隨煙株生長發(fā)生明顯變化，這些微生物菌群改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致煙田土壤健康狀況發(fā)生了改變。屬水平上，細(xì)菌除相對豐度最高的norank_ f__Acidobacteriaceae__Subgroup_1_（酸桿菌科下的屬），其它均在整個生長時期發(fā)生顯著變化。真菌中變化最顯著的仍是norank_k__Fungi，其它具有顯著差異的菌種均屬于子囊菌門。

圖6 煙田土壤微生物在門水平上的物種差異分析

圖7 煙田土壤微生物在屬水平上的物種差異分析

3 小結(jié)與討論

土壤微生物與植物關(guān)系十分密切，植物在生長過程中主要通過根系分泌物影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)［20］。本實(shí)驗(yàn)中煙株在旺長期對土壤微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)影響最大。細(xì)菌和放線菌在旺長期數(shù)量最多，是因?yàn)橥L期煙株根系大量可溶性的分泌物為細(xì)菌提供了足夠的有效性碳源所致。煙株生長的后期根系分泌物減少，土壤中細(xì)菌數(shù)量隨之減少［21］。真菌數(shù)量變化規(guī)律和細(xì)菌、放線菌剛好相反，可能是因?yàn)檎婢鷮儆谡婧松?，受環(huán)境變化反應(yīng)較慢，細(xì)菌、放線菌在旺長階段大量繁殖爭奪營養(yǎng)資源、空間資源等迫使真菌生長受到了限制；也有可能是真菌Ascomycota在煙株旺長期的大量增殖抑制了其它真菌的生長，從而使真菌的整體數(shù)量減少。以往的研究發(fā)現(xiàn)，提高土壤細(xì)菌微生物多樣性能夠降低煙草青枯病的發(fā)病率［22］，而邵武地區(qū)煙田土壤微生物的群落多樣性指數(shù)均較高，且健康和非健康煙田之間也無明顯差異。這可能是因?yàn)楫?dāng)土壤微生物具有高水平的多樣性時，可能會達(dá)不到預(yù)期的抑病-多樣性關(guān)系的發(fā)展［23］。

旺長期是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化的重要時期。細(xì)菌Acidobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes等豐度減少，Actinobacteria、Firmicutes、Planctomycetes等豐度增多，這些細(xì)菌微生物所共同構(gòu)成的土壤微生物區(qū)系可能與煙草青枯病的爆發(fā)存在一定的聯(lián)系。Actinobacteria中的微球菌科（Micrococcaceae）豐度在旺長期較團(tuán)棵期增加了4.71倍，且健康煙田土壤中該菌的豐度高于非健康煙田土壤，Wu等［24］通過試驗(yàn)對照發(fā)現(xiàn)，石灰+碳酸氫銨+生物有機(jī)肥處理后煙草青枯病發(fā)病率降低，微球菌科的豐度在處理組的豐度明顯高于對照組，說明微球菌對煙草青枯病發(fā)生有一定的抑制作用。Firmicutes中的芽孢桿菌屬，已有大量的研究證明芽孢桿菌對青枯病的抑制有良好的效果。許多芽孢桿菌能分泌大量的酶和抗生素，蘇阿德等［25］發(fā)現(xiàn)用芽孢桿菌處理番茄種子能夠有效地控制番茄青枯病，其中枯草芽孢桿菌的效果最好，本實(shí)驗(yàn)中煙株采摘期土壤中芽孢桿菌屬在健康煙田中的豐度高于非健康煙田，也佐證了該論點(diǎn)。邵武煙田土壤中Ascomycota豐度在煙株生長后期高達(dá)90%左右，且非健康煙田土壤中的豐度明顯大于健康煙田。研究表明部分寄生的子囊菌可引起植物的多種病害［26］，土壤中營寄生的子囊菌在煙株旺長期大量增殖并對煙草根部進(jìn)行破壞，為青枯菌入侵煙株內(nèi)部提供途徑，增加了煙株感染幾率。感染青枯病的煙株逐漸死亡后，根部又會聚集大量的腐生類子囊菌，從而繼續(xù)對周圍健康煙株發(fā)生破壞作用。Ascomycota（在非健康煙田土壤中豐度較大），可能對煙株健康生長不利，norank-k-Fungi豐度僅次于Ascomycota，在健康煙田土壤中豐度較高，可能表明norank-k-Fungi屬于有益菌。因此，上述結(jié)果表明，真菌優(yōu)勢菌種Ascomycota、norank-k-Fungi可能與煙草青枯病的發(fā)生有關(guān)。

煙草青枯病是福建煙草的主要病害，一般在每年4月下旬或5月上旬由南向北開始發(fā)生，5月中、下旬遇上適宜的氣候（高溫多雨）即開始大量爆發(fā)［27］。邵武地區(qū)煙株5月上旬煙草青枯病開始流行，此時煙株已處于旺長期中后期，土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)變化最為明顯。因此，從本研究的結(jié)果進(jìn)行推論表明，煙株的旺長期是防治青枯病較為關(guān)鍵的時期，在旺長期施加微生物調(diào)控的措施以提高微生物多樣性和有益菌數(shù)量，減少致病菌特別是Ascomycota數(shù)量，維持和穩(wěn)定土壤微生態(tài)的健康，可預(yù)防青枯病等土傳病害的發(fā)生。