史愛英

(錦州市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科,遼寧 錦州121000)

宮頸癌(CC)是嚴(yán)重威脅婦女健康和引起婦女死亡的主要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)VEGF在調(diào)控腫瘤血管生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2,3]。本研究中，通過建立CC細(xì)胞株，并通過干擾VEGF表達(dá)，檢測(cè)VEGF下調(diào)對(duì)CC細(xì)胞的存活及凋亡的影響，從而進(jìn)一步深入探索VEGF在CC發(fā)病中扮演的角色，為臨床開發(fā)更加高效合理的治療方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。根據(jù)已有方法[4]，將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，然后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其隨機(jī)分為2組：Control組(只加Lipofectamine)，VEGF干擾組(給予VEGF-siRNA處理，si-VEGF組)。將細(xì)胞接種于96孔板(密度為4×103/孔)，并根據(jù)lipofectamine RNA imax說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2 劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后24 h，用200 μl槍頭在兩組細(xì)胞分別制造均勻劃痕。經(jīng)PBS漂洗后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于培養(yǎng)0 h和24 h，分別檢測(cè)各組劃痕。

1.3 CCK-8試驗(yàn)

將穩(wěn)定感染后的兩組細(xì)胞接種于96孔板，并設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。于細(xì)胞培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、36 h、48 h和72 h)，在各組細(xì)胞分別加入CCK-8試劑(10 μL/孔)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔OD值。

1.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot assay)

取VEGF干擾后48 h的Control組和si-VEGF組細(xì)胞，根據(jù)BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書分別提取各組細(xì)胞總蛋白，并檢測(cè)蛋白濃度。通過SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉后加入一抗(Bax,1:500，購自Abcam公司;Bcl-2,1:1000，購自Abcam公司)，4 ℃過夜。其后， PBS漂洗后加入二抗，并室溫孵育1 h。最后，采用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)( GEL DOC EZ IMAGER，Bio-rad，California，USA)進(jìn)行曝光，并使用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 VEGF干擾對(duì)Hela細(xì)胞遷移的影響

為了探索VEGF干擾對(duì)Hela細(xì)胞遷移的影響，我們?cè)诩?xì)胞干擾后實(shí)施了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，并且于劃痕后0 h和24 h分別進(jìn)行拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后Control組劃痕因細(xì)胞遷移明顯變窄(圖1 A-B)，而si-VEGF組劃痕仍保持較寬水平(圖1 C-D)。

2.2 VEGF干擾對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)后36 h si-VEGF組細(xì)胞活性低于Control組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,圖2)；細(xì)胞培養(yǎng)48 h和72 h，si-VEGF組細(xì)胞活性均明顯低于Control組(P<0.05,圖2)。

圖1 VEGF干擾抑制Hela細(xì)胞遷移

(A,C)顯示Control組和si-VEGF組劃痕后0 h細(xì)胞情況；(B,D)顯示Control組和si-VEGF組劃痕后24 h細(xì)胞遷移情況。

圖2 VEGF干擾抑制Hela細(xì)胞增殖

Control組只加入Lipofectamine，si-VEGF組給予VEGF-siRNA處理。*P<0.05，與Control組比較。

2.3 VEGF干擾后對(duì)細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

為了檢測(cè)VEGF干擾對(duì)Hela細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，我們通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)VEGF干擾后48 h Control組和si-VEGF組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與Control組比較，si-VEGF組Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05,圖3A,C)，而Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05,圖3B,D)。

圖3 VEGF干擾對(duì)Hela細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

(A,C)顯示VEGF干擾后Control組和si-VEGF組Bax蛋白表達(dá)水平；(B,D)顯示VEGF干擾后Control組和si-VEGF組Bcl-2蛋白表達(dá)水平。*P<0.05，與Control組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

CC是導(dǎo)致發(fā)展中國家婦女死亡的主要原因[5，6]。研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)CC的主要因素包括人乳頭瘤病毒感染[7]、吸煙、年齡過早的性交、性伴侶數(shù)量過多和慢性免疫抑制等[8]。目前，手術(shù)、放/化療是治療CC的主要方法[9]。然而，由于CC的臨床癥狀和體征直到癌癥晚期才出現(xiàn)，因此導(dǎo)致CC治療效果較差。因此，找到一種更加合理、高效的檢測(cè)方法和治療靶點(diǎn)，是提高CC患者預(yù)后，減少CC死亡率的有效方法。

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須依賴豐富的營(yíng)養(yǎng)供給，而血管生成是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾獥l件[10]。研究表明，VEGF能促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲和血管形成，從而加速腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[11-13]。Saharinen P指出VEGF能夠改變淋巴管內(nèi)皮黏附特性，增加細(xì)胞/趨化因子分泌，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14]。Fujimoto J等發(fā)現(xiàn)VEGF高表達(dá)能夠促進(jìn)CC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，生存率明顯降低[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)VEGF干擾后表達(dá)下調(diào)能明顯抑制CC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過去研究結(jié)論相符。本研究進(jìn)一步證明了VEGF在CC中同樣發(fā)揮重要作用，是促進(jìn)CC增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。此外，VEGF干擾后Bax蛋白表達(dá)上調(diào)和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)也證明VEGF的表達(dá)與凋亡相關(guān)蛋白密切相關(guān)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究將有助于進(jìn)一步深入闡明VEGF在CC中的相關(guān)分子機(jī)制，為臨床開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和制定更加合理有效的治療方案提供更好的理論支持。