苗永迪，劉文曄，趙 雷，趙書涵，豈 蕊，王隱瑜，鄭晨曦，孫 聰

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春130117)

肺纖維化(PF)是臨床上常見(jiàn)的疾病[1,2]。黃芩苷是中藥黃芩的活性成分，黃芩苷可抑制成纖維細(xì)胞合成相應(yīng)基質(zhì)從而介導(dǎo)炎癥性疾病的發(fā)生。本研究利用不同濃度的黃芩苷干預(yù)體外培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)觀察中藥單體黃芩苷對(duì)人肺成纖維細(xì)胞中纖維黏連蛋白(FN)的mRNA及蛋白表達(dá)，探討黃芩苷抑制人肺成纖維細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1細(xì)胞系 HFL1細(xì)胞系(人肺成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞系)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，置于10%優(yōu)級(jí)胎牛血清Hepes調(diào)節(jié)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 黃芩苷純度為91.7%，編號(hào)為XEBJ-6RQ3，購(gòu)自中國(guó)藥品檢定研究所；醋酸潑尼松片，生產(chǎn)批號(hào)為20131114，購(gòu)自天津天藥藥業(yè)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、FN polyclonal antibody購(gòu)自杭州博日生物科技。

1.1.3引物 引物由上海生工合成，序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HFL1細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，放置恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為37℃、5%CO2。每天固定時(shí)間觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上時(shí)，加2 ml的0.25%胰酶進(jìn)行消化90 s，計(jì)數(shù)傳代。

1.2.2細(xì)胞分組及給藥 將混懸后的細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即陽(yáng)性藥組、黃芩苷高濃度組、黃芩苷中濃度組、黃芩苷低濃度組、空白組，每組細(xì)胞為2×105。精密稱取黃芩苷，用DMEM培養(yǎng)基稀釋濃度依次為10 mM、5 mM和1 mM，稱取醋酸潑尼松片于DMEM培養(yǎng)基中溶解，配成終濃度為1 mM，將細(xì)胞混懸液進(jìn)行離心棄去上清液，加入含有相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基。

1.2.3細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，使貼壁的細(xì)胞吹打成混懸液，并接種在96孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁狀態(tài)，加入含有黃芩苷的培養(yǎng)基，每組在培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后加MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，離心棄掉上清，加入DMSO試劑150 μl，室溫振蕩20 min。待晶體溶解后測(cè)570 nm處的吸光度，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，記錄結(jié)果。

1.2.4mRNA檢測(cè) 選用β-actin為內(nèi)參，Trizol法進(jìn)行總RNA提取，RT-PCR擴(kuò)增步驟根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作。本擴(kuò)增體系共循環(huán)30次，最后保持72℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)FN的擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣順序?yàn)殛?yáng)性藥組、黃芩苷高濃度組、黃芩苷中濃度組、黃芩苷低濃度組、空白組。反應(yīng)條件如表2。

1.2.5蛋白檢測(cè) 將混勻后的細(xì)胞液離心棄上清，加細(xì)胞裂解液提取總蛋白，煮沸使蛋白變性，SDS-PAGE電泳上樣量為10 μl，封閉液封閉3 h，一抗(β-actin、FN)4℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后DAB顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值掃描。

表2 PCR反應(yīng)條件

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Image J軟件對(duì)NC膜上的條帶灰度分析，利用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析，比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

空白組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)懸浮細(xì)胞且生長(zhǎng)速度快、貼壁面積分布廣；醋酸潑尼松陽(yáng)性藥組有半數(shù)細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，隨時(shí)間增長(zhǎng)懸浮量呈逐漸上升趨勢(shì)；黃芩苷各濃度組部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)瓶中，高濃度組較多，中濃度組次之，低濃度組較少。各給藥組干預(yù)細(xì)胞72 h，細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果見(jiàn)表3，MTT結(jié)果表明黃芩苷對(duì)HFL1細(xì)胞有較大程度的增殖抑制效果，高濃度組抑制最為明顯，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 MTT測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

2.2 FN mRNA表達(dá)結(jié)果

醋酸潑尼松組和黃芩苷各濃度組干預(yù)下，F(xiàn)N mRNA表達(dá)明顯下降，與空白組比較有顯著差異(P<0.01)；組間差異比較結(jié)果顯示，F(xiàn)N mRNA黃芩苷高濃度組與中、低濃度組相比有顯著差異(P<0.01)，F(xiàn)N mRNA中濃度組與低濃度組比較有差異(P<0.05)，如圖1。

注：與空白組比較△P<0.01，與醋酸潑尼松組比較▲P<0.01

2.3 FN蛋白表達(dá)結(jié)果

在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，HFL1細(xì)胞中FN蛋白表達(dá)水平均有下降，F(xiàn)N蛋白黃芩苷高、中濃度組、醋酸潑尼松組相比空白組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，低濃度組與空白組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。FN蛋白黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，有顯著性差異(P<0.01)，F(xiàn)N蛋白高濃度組與中、低濃度組比較均有顯著性差異(P<0.01)，中濃度組與低濃度組比較亦有顯著性差異(P<0.01)，如圖2。

注：與空白組比較△P<0.01,與醋酸潑尼松組比較▲P<0.01

3 討論

肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HFL1的增殖受大量細(xì)胞因子的調(diào)控，在體內(nèi)細(xì)胞因子的正性與負(fù)性調(diào)控失衡時(shí)，引起肺成纖維細(xì)胞的大量增殖，進(jìn)而誘發(fā)肺纖維化[3]。FN是廣泛存在的非膠原糖蛋白，肺纖維化病變時(shí)肺內(nèi)FN含量明顯增高，提示FN早期存在于肺成纖維細(xì)胞中，對(duì)肺纖維化的形成有一定的影響[4，5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)HFL1細(xì)胞，以醋酸潑尼松為陽(yáng)性藥對(duì)照組，觀察黃芩苷高濃度組10 mM、中濃度組5 mM和低濃度組1 mM干預(yù)HFL1的增殖效果，孵育72 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)給藥干預(yù)后HFL1細(xì)胞中FN蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)HFL1細(xì)胞抑制效果呈濃度依賴性，高濃度組與陽(yáng)性藥組抑制效果相當(dāng)，說(shuō)明黃芩苷可有效的抑制HFL1細(xì)胞的增殖；Western-blotting和RT-PCR結(jié)果顯示，黃芩苷可有效降低FN蛋白及mRNA的表達(dá)，且濃度在10 mM、5 mM時(shí)效果明顯，與空白組比較有顯著差異，表明FN在轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程中均受抑制，提示黃芩苷的抑制作用在RNA水平已有較好的效果，為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究提供基礎(chǔ)。肺纖維化的發(fā)生發(fā)展與FN表達(dá)量密切相關(guān)，本研究證實(shí)黃芩苷可有效抑制FN的表達(dá)，進(jìn)而改善肺纖維化的病變，為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。