劉 飛，郭 偉,王志成*

(1.武警吉林總隊(duì)醫(yī)院第二門診部,吉林 長(zhǎng)春130052；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院國(guó)家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成為繼心血管疾病、腫瘤之后的另一個(gè)嚴(yán)重危害居民健康的重要慢性代謝性疾病，本研究通過(guò)鏈尿佐菌素(STZ)藥物誘導(dǎo)Wistar大鼠的糖尿病模型，進(jìn)而給予低劑量電離輻射(LOR)，探討其抗氧化活性和降低凋亡的作用，為糖尿病腦損傷的保護(hù)提供新思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

STZ及DCFH-DA(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血糖儀及配套試紙購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；AnnexinⅤ/FITC試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；MDA、SOD和CAT試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究院；β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；X-RAD 320iX生物輻照儀購(gòu)自美國(guó)Precision X-ray公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SXCK(吉)203-2007，實(shí)驗(yàn)前大鼠室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境一周，自由進(jìn)水、進(jìn)食，60只雄性大鼠進(jìn)行造模，造模成功大鼠進(jìn)行分組。

1.3 STZ誘導(dǎo)糖尿病模型

造模前大鼠禁食12 h，不禁水，造模時(shí)按照50 mg/kg進(jìn)行STZ(10 g/L)左下腹腔一次性注射，注射2 d后檢測(cè)空腹12 h尿糖，取尿糖“+++”者再次注射STZ，3 d后取尾靜脈血測(cè)空腹12 h血糖，血糖大于16.7 mmol/L，且具有多飲、多食、多尿現(xiàn)象，確定為糖尿病模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

正常大鼠10只，以及造模成功的糖尿病大鼠40只，分成正常組、模型組、模型+25 mGy、模型+50 mGy和模型+75 mGy組，每組10只。LDR照射劑量率為12.5 mGy/min，電壓180 kV，電流15 mA，隔日照射，照射12次，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)4周。

1.5 生化法檢測(cè)MDA、SOD和CAT

LDR照射后4周，麻醉后處死大鼠，冰上取出大腦，輕輕剝離海馬，每組4只大鼠的海馬在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入玻璃離心管中，并加入9倍體積的冷勻漿介質(zhì)，用組織剪將其剪碎，超聲粉碎儀將組織勻漿后分裝在EP管中，制備好的10%海馬組織勻漿，測(cè)定蛋白濃度。分別采用MDA、SOD和CAT試劑盒檢測(cè)MDA含量、SOD和CAT活力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和ROS

3只大鼠海馬放置5 ml 0.01 M PBS中，利用毛玻璃輕輕研磨成單細(xì)胞懸液，并經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1 500 rpm離心5 min后，計(jì)數(shù)，定容后待測(cè)。每組取5×105個(gè)細(xì)胞，加入450 μl Buffer，2 μl的Annexin V和5 μl的PI；室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡；另取1 × 106個(gè)細(xì)胞，加入40 μl(20 mmol/L)的DCFH-DA，37℃孵育30 min；PBS洗2次后1500 r/min離心5 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平；Cell Quest 軟件分析結(jié)果，并以百分率表示。

1.7 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)

此處引用的是《詩(shī)經(jīng)·桃夭》的內(nèi)容，是一首祝賀年輕姑娘出嫁的詩(shī)。這是前半夜唱的敘舊歌，表達(dá)姑娘對(duì)美好愛(ài)情與幸?；橐龅你裤剑氲玫揭粋€(gè)如意之人。

每組3只大鼠的海馬，提取總蛋白并進(jìn)行定量，蛋白變性后每組取25 μg上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，濃縮膠采用60 V恒壓，分離膠采用120 V恒壓。蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜后，利用新鮮配置的封閉液(1×TBST,5%脫脂奶粉，0.05%的Tween-20)常溫封閉1 h，分別按照1∶1000(β-actin)和1∶500(Bcl-2、Bax和caspase-3)進(jìn)行一抗孵育，4℃過(guò)夜，用含0.05% Tween-20的TBST洗3次，每次10 min，繼而按照1∶1000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃震蕩孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，利用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光，X線片曝光顯影，照相后分析蛋白的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LDR對(duì)大鼠血糖水平的影響

造模成功后未進(jìn)行LDR前，DM和DM+LDR組大鼠血糖水平均高于16.7 mmol/L，且各組間無(wú)明顯差異，表明模型為糖尿病模型，可以用于后續(xù)研究(表1)。給予25、50和75 mGy照射后2周，血糖繼續(xù)增加，且顯著高于Control組(P<0.05)，各劑量組間無(wú)顯著差異；照射后4周，DM組血糖水平升高到25.33 mmol/L，LDR各組均顯著低于DM組(P<0.05，表1)；而LDR照射結(jié)束后4周，DM組血糖仍維持在高水平，25、50和75 mGy照射組血糖均有下降趨勢(shì)，且以75 mGy降低最多。

表1 各組大鼠血糖水平

注：*P<0.05 vs Control group，#P<0.05 vs DM group

2.2 LDR對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷的影響

模型大鼠經(jīng)LDR后4周，檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力，結(jié)果顯示，與Control組比較，DM組ROS水平和MDA含量顯著升高(P<0.05，表2)，而SOD和CAT活力未見(jiàn)明顯改變；而給予25、50和75 mGy LDR后，ROS水平和MDA含量則較DM組顯著降低(P<0.05，表2)，且SOD和CAT活力仍處于較低水平(P<0.05，表2)。

表2 各組Wistar大鼠經(jīng)LDR后ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力

注：*P<0.05 vs Control group，#P<0.05 vs DM group

2.3 LDR對(duì)模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分比的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(圖1)：海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分比Control組為(6.85±0.75)%、DM組為(28.51±2.47)、DM+25 mGy組為(18.56±2.66)%、DM+50 mGy組(14.83±1.59)%和DM+75 mGy組為為(13.88±2.98)%；與Control組比較，DM和DM+LDR組凋亡百分比均顯著增加(P<0.05)，與DM組比較DM+LDR組凋亡百分比則顯著降低(P<0.05)。

2.4 LDR對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

模型大鼠經(jīng)LDR后4周，檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)，由圖2可見(jiàn)，DM模型組Bcl-2表達(dá)降低，而Bax和caspase-3均增加，暗示凋亡的增加；而DM大鼠經(jīng)LDR后Bcl-2表達(dá)增加，而Bax和caspase-3表達(dá)則降低，暗示LDR降低了DM大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，與流式結(jié)果相似。

圖1 利用AnnexinⅤ/FITC試劑盒流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Wistar大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡

圖2 Western blot檢測(cè)Wistar大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)

3 討論

STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠高血糖在大腦各個(gè)區(qū)域神經(jīng)的降解起到重要作用，包括扣帶回皮質(zhì)、丘腦核和海馬體，主要和ROS的產(chǎn)生有關(guān)[1]。海馬體對(duì)近期主要記憶具有重要作用，并將其存入大腦皮層轉(zhuǎn)變成永久記憶。海馬體在記憶和學(xué)習(xí)中的重要作用已經(jīng)得到充分的認(rèn)識(shí)，海馬受損的患者記憶力明顯下降，并可能患有焦慮癥。研究表明，糖尿病時(shí)葡萄糖對(duì)神經(jīng)的毒性作用也是因?yàn)樵鰪?qiáng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的氧化進(jìn)而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的增加[2]。在本研究的動(dòng)物模型中，海馬神經(jīng)元細(xì)胞ROS水平和MDA含量均顯著高于正常組，暗示糖尿病模型處于氧化損傷狀態(tài)。另外，氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞可以誘導(dǎo)凋亡，研究表明糖尿病時(shí)海馬細(xì)胞由高血糖誘導(dǎo)的凋亡是海馬損傷的一個(gè)重要途徑[3,4]。而且在凋亡過(guò)程中，凋亡的線粒體調(diào)控途徑涉及到持續(xù)的高血糖狀態(tài)可以產(chǎn)生過(guò)量的ROS，使得線粒體膜電位及滲透性發(fā)生變化，膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，膜去極化，使得線粒體內(nèi)促凋亡因子釋放到細(xì)胞漿中，激活caspase-3，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)凋亡；另外，Bcl-2/Bax對(duì)于調(diào)控膜的通透性具有重要的作用[5]。本研究所構(gòu)建的糖尿病大鼠模型中，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加，且Bcl-2表達(dá)降低、Bax和caspase-3表達(dá)增高，暗示相應(yīng)的線粒體通路被激活。

長(zhǎng)期的高血糖會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，針對(duì)性治療可以有效緩解相應(yīng)的并發(fā)癥。研究者利用番茄紅素(lycopene)治療糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示可以降低氧化損傷，并且降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的外周炎癥和認(rèn)知損傷的發(fā)展，而且也能降低線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6,7]。由此可見(jiàn)，以降低氧化損傷為目的的糖尿病神經(jīng)損傷將具有重要的意義。低劑量電離輻射是單次照射劑量小于0.2 Gy，劑量率控制在0.05 Gy/min以內(nèi)的劑量[8]。以往研究顯示可通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化活性對(duì)大腦進(jìn)行保護(hù)作用，且LDR對(duì)大腦不具有損傷效應(yīng)[9,10]。在本研究中，25、50和75 mGy的LDR對(duì)糖尿病模型大鼠的血糖具有一定的控制作用，但并未達(dá)到完全逆轉(zhuǎn)的效果。而且，也降低DM大鼠海馬ROS水平和MDA含量，暗示可以降低氧化損傷，未能顯著提高抗氧化能力。同時(shí)，也降低了DM大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和線粒體途徑相關(guān)分子的表達(dá)。由此可見(jiàn)，LDR可以通過(guò)降低氧化損傷、抑制凋亡的誘導(dǎo)，從而發(fā)揮控制血糖的作用，有可能是一個(gè)較好的糖尿病腦并發(fā)癥控制的新思路。

總之，本研究通過(guò)STZ建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并給予LDR照射治療，結(jié)果顯示糖尿病大鼠海馬的氧化損傷和凋亡誘導(dǎo)增加，且LDR具有一定的緩解作用，這為L(zhǎng)DR控制糖尿病腦損傷的研究提供了必要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。